产β-甘露聚糖酶内生菌

植物内生菌研究已经成为微生物研究的热点[1],最初主要集中于拮抗菌的筛选,近几年更关注于生物活性物质的分离.最近有报道,将从植物内生菌作为一种开发工业用酶资源的新角度去研究[2],这为继续开发其它工业用酶或生物活性物质的内生菌的研究提供了理论依据,从而拓宽了植物内生菌的应用研究范围.     

木聚糖酶和甘露聚糖酶在毕赤酵母中的共表达及产酶分析

木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种重要的半纤维素酶,也是两种重要的饲用酶制剂,通过毕赤酵母表达系统中的体外串联表达盒构建多拷贝的方法构建了木聚糖酶DSB和甘露聚糖酶Man A共表达重组质粒p PICZαA/DSB-ManA,将该重组质粒电转化至宿主菌毕赤酵母X33中获得共表达两种酶的重组菌X33/DSB-ManA,实现了两种酶的共分泌表达,经诱导表达后木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活分别为273. 6 U/ml和256. 8 U/ml,为单独表达重组菌X33/DSB和X33/Man A酶活的30. 4%和73. 4%。酶学性质的分析显示DSB和Man A的最适反应温度均为75℃,在45℃～75℃范围内具有较好的温度稳定性,酶活可保持最高酶活的60%以上; DSB最适pH为6. 5,Man A最适pH为6. 0,在pH 3. 0、40℃条件下,Man A处理1h能保持最高酶活的80%以上,DSB处理1 h时能保持最高酶活的50%以上; DSB和Man A对多种金属离子和化学试剂(浓度为1 mM)具有较好的耐受性,均可保留60%以上的酶活力。通过单一菌株成功完成了不同酶的共表达,为复合酶饲料添加剂的生产和应用研究提供了一定的理论依据。     

β-葡萄糖苷酶与透明颤菌血红蛋白在大肠杆菌中的共表达

为解决大肠杆菌高密度发酵生产β-葡萄糖苷酶过程中溶氧不足的问题,分别采用双顺反子和T7启动子系统在Escherichia coli中引入透明颤菌血红蛋白(VHb)以改善溶氧的利用、提高菌体的生物量,进而增加β-葡萄糖苷酶的产量。以双顺反子形式诱导表达VHb时,在摇瓶低溶解氧条件下的最高生物量达到4.24±0.29(OD_(600)),与无VHb表达的对照组相比提高了35.03%,同时β-葡萄糖苷酶发酵酶活达到了(9.78±0.55)U/m L,比对照组提高了25.38%。在3 L发酵罐中使用双顺反子形式共表达VHb时,β-葡萄糖苷酶发酵总酶活达到141.23 U/m L,与无VHb表达的对照相比提高了35.57%。以T7启动子对VHb进行表达后,在摇瓶和发酵罐中β-葡萄糖苷酶的发酵酶活均低于对照组。这些结果表明,在大肠杆菌中以双顺反子形式共表达β-葡萄糖苷酶和VHb能够提升菌体对低溶氧的耐受能力,提高菌体生物量和β-葡萄糖苷酶的产量。     

RT-PCR检测毕赤酵母外源β-甘露聚糖酶基因拷贝数

利用荧光定量PCR方法检测毕赤酵母外源β-甘露聚糖酶基因(man)拷贝数。以毕赤酵母中高度保守基因三磷酸甘油醛脱氢酶基因(gap)为内参基因,分别构建含有gap和man的克隆质粒,进行RT-PCR反应构建gap和man双标准曲线;获得的双标准曲线具有良好的重复性,其相关系数(R2)均为0.999,其扩增效率分别为105.1%和102.2%。提取含有外源man基因的毕赤酵母基因组进行RT-PCR检测,通过双标准曲线计算出外源man基因的拷贝数。结果显示:预先经过博莱霉素(Zeoicn)抗性筛选得到的10株毕赤酵母重组菌株中含有1、2、3、4、5和7个不等拷贝的β-甘露聚糖酶基因。结果表明该方法能够高效快速筛选和鉴定出含有不同外源β-甘露聚糖酶基因拷贝数的毕赤酵母重组菌株。     

毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达

解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了改善高密度发酵生产Y1Lip2过程中的溶氧限制,提高Y1Lip2的表达量,将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb分别置于AOXl启动子和PsADH2启动子的调控之下,进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达.PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis,在低氧条件下能被激活.SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明,Y1Lip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达.在氧限制性条件下,VHb表达的细胞(VHb+,GS 115/9Klip2-pZPVT)与对照细胞(VHb-,GS 115/9Klip2)相比,摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25％和83％.此外,在低氧条件下,VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb-细胞高.文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS 115/9Klip2-pZP VTlip2 49#,在低氧条件下,该克隆子在10L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL.因此,在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb,同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略.     

两拷贝β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

目的:旨在获得高效分泌表达的两拷贝β-甘露聚糖酶(β-mannase)毕赤酵母工程菌株。方法:以作者研究室保藏的黑曲霉β-mannase X33菌株(X33-β-mannase)为出发菌株,体外构建两拷贝重组质粒pPIC-mannase,用电击法转化至X33感受态细胞,用抗生素Zeocin筛选阳性转化子,用BMGY培养基培养,BMMY诱导其表达,利用DNS法测定酶活。结果:实验已成功构建了两拷贝β-mannase毕赤酵母工程菌株,50 L发酵罐培养7 d后,β-mannase产酶水平达到21 300 U/ml。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

β-甘露聚糖酶产生菌的分离、鉴定及产β-甘露聚糖酶最适条件的研究

以采集的土壤样品为试验材料,经过富集培养及分离纯化,筛选出2株产β-甘露聚糖酶的菌株.采用摇瓶培养分别测定其酶活力,其中1株菌株酶活力较高,酶活力达50.36 U/ml.生理生化性质鉴定及16S rDNA序列相似性结果表明该菌为假单孢菌(Pseudomonas sp.).产酶的最适条件研究发现,1 g/100 ml玉米粉,2 g/100 ml魔芋粉,pH6.0,32℃为最优产酶条件,酶活力达185.37 U/ml,是优化前的3.68倍.该菌产酶迅速,培养12 h后已达产酶高峰.粗酶的性质研究发现,该酶是一种酸性的甘露聚糖酶,作用的最适pH为4.0,最适反应温度为55℃;该酶的稳定性较好,在pH4.0～6.0、温度为40～55℃保持较好的稳定性.     

共表达HAC1和分子伴侣基因对甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响

为了提高甘露聚糖酶ManA在毕赤酵母中分泌表达的酶活,选择毕赤酵母内质网未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)激活调控因子HAC1与5种毕赤酵母蛋白折叠相关的分子伴侣ERO1、PDI、PDI1、CPR5、BiP,通过构建pPICZA-HAC1等6种胞内表达重组质粒,分别电转化至分泌表达ManA的毕赤酵母重组菌中胞内共表达,并分析其重组菌摇瓶发酵时ManA表达的影响。结果发现在摇瓶发酵水平,胞内共表达HAC1、ERO1、PDI的重组菌发酵上清液中的ManA酶活力分别提高了26%、15%、20%,其重组菌发酵上清液的酶活力分别达到1 014 U/mL、925 U/mL、965 U/mL。通过对各重组菌上清液酶活力、胞内滞留酶活力、上清液蛋白浓度数据进行分析,进一步选择将HAC1、ERO1、PDI进行两基因或三基因组合,并分别在分泌表达ManA的重组菌胞内共表达,但各共表达重组菌发酵上清液的酶活力都没有进一步的提升。单独共表达HAC1或者分子伴侣ERO1、PDI可以辅助ManA的正确折叠,提高其蛋白表达。     

透明颤菌血红蛋白的表达对酵母中麦角固醇合成的影响

构建了含透明颤菌（Vistreoscilla）血红蛋白基因vgb和酵母遗传霉素（G418）抗性基因的重组质粒pVgbkanMX4,转化至酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1190中,经过分析,基因vgb在酵母细胞中得到表达。对重组菌和野生菌进行了摇瓶培养及5 L发酵罐培养的研究。在摇瓶实验中,重组菌的麦角固醇产量比野生菌有显著提高,在野生菌中的含量为0.573%、而在重组菌中的产量为1.07%。 经过30 h发酵罐培养的实验,野生菌中麦角固醇含量为0.9%,重组菌中其含量为1.38%,验证了摇瓶实验的结果。结果证明vgb基因有利于酵母中麦角固醇的合成。     

耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析

目的:克隆黑曲霉β-甘露聚糖酶基因,研究该基因在毕赤酵母中的表达情况。方法:运用RT-PCR从黑曲霉AN070902中克隆β-甘露聚糖酶cDNA片段,与载体pPIC9K相连,构建重组载体VMAN-pPIC9K,电转化毕赤酵母GS115,筛选产酶最高菌株进行5 L液体发酵,对该菌株所产重组酶进行酶学性质分析。结果:克隆获得1152 bpcDNA,编码由383个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质属于GH5家族,理论pI和相对分子质量分别为4.48和41.6×103;筛选获得的重组菌株VMAN-pPIC9K-GS115在5 L液体发酵中上清酶活达11 785 U/mL;表达的重组酶是一种酸性β-甘露聚糖酶,最适反应pH值为3.0,经pH2.0～9.0处理2 h后剩余酶活保持90%以上;该重组酶最适反应温度为65℃,70℃处理1 h后剩余酶活保持75%以上;该重组酶活性被1 mmol/L的Fe3+和Mn2+显著抑制,被1mmol/L的Co2+显著激活。结论:重组耐酸性β-甘露聚糖酶的特性,决定了其在工业生产中,特别是动物饲料和食品加工中具有应用价值。     

碱性β-甘露聚糖酶发酵工艺的研究

本文报道碱性β-甘露聚糖酶16L罐的发酵工艺。在发酵过程中,通气量影响菌体生长,最适通气量为1:0.75—1:1.0vvm。搅拌速度影响菌体产酶,最适搅拌速度为500r/min。碳源为魔芋粉,其适宜浓度为2%。发酵周期为40小时。发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活力达300u/ml,比摇床上培养提高了2倍。     

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶固体发酵条件的优化

芽孢杆菌是产甘露聚糖酶的优良菌株,首次研究芽孢杆菌固体发酵条件的优化。以天然麸皮作为基本原料,研究利用枯草芽孢杆菌WY34固体发酵生产β-片露聚糖酶的发酵条件。最佳固体发酵培养条件为：麸皮5g,初始水分含量71％,初始pH7．0,接种量为2mL,1％Tween-80,0.4g魔芋粉,培养温度50℃。在最适条件下培养5d,甘露聚糖酶酶活高达7,650U／g干基,是未优化前酶活的2．78倍。     

黑曲霉固态发酵苹果渣产β-甘露聚糖酶的工艺优化

目的:对黑曲霉SL-08固态发酵苹果渣生产β-甘露聚糖酶的生产工艺进行优化,旨在探寻苹果渣的综合利用方式,降低β-甘露聚糖酶的生产成本。方法:采用Plackett-Burman试验设计和响应面法进行优化。结果:最佳培养基组成为苹果渣与棉粕1∶1(w/w)、尿素2%(w/w)、KH2PO40.1%(w/w)、初始含水率59%(w/w)、CaCl20.2%(w/w)、MgCl20.1%(w/w),30℃恒温培养48h,β-甘露聚糖酶酶活力可达539U/g干曲,比基础培养基提高了28.3%,达到了以豆粕与麸皮为生产原料时的产酶水平。结论:采用黑曲霉SL-08对苹果渣进行固态发酵是一种有效的生物转化方式,既可用于β-甘露聚糖酶的生产,取代豆粕与麸皮等常规原料,降低生产成本;也可以对苹果渣进行综合利用。     

硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的组成型分泌表达

目的：构建硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母组成型分泌表达菌株,研究重组菌株的产酶水平。方法：EcoR I／Xba I双酶切质粒pPIC-mann-opt,琼脂糖凝胶电泳、回收目的基因片段后,与组成型毕赤酵母表达载体pGAPzαA连接,转化大肠杆菌,经筛选获得含有pGAP-mann-opt的重组克隆;提取pGAP-mann-opt,用限制性内切酶BspH I线性化后,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,进行Zeocin抗性筛选和PCR鉴定。结果：获得了重组菌株,重组菌株在YPD培养基中摇瓶发酵24h,上清液酶活达到343U／mL,产酶蛋白约为1.0mg／mL。结论：构建的硫色曲霉β-甘露聚糖酶组成型表达菌株具有较好的应用前景。     

透明颤菌血红蛋白的研究进展

血红蛋白广泛存在于动植物、微生物中,是一种氧结合蛋白。透明颤菌血红蛋白是20世纪70年代后期发现的一种血红蛋白,该蛋白质能使细菌在低氧的情况下生存,并保持较高的生长速率。随着作用机理研究深入,透明颤菌血红蛋白在发酵工业和植物转基因等生物工程领域有着广泛的应用。     

β-甘露聚糖酶产生菌R10的产酶特性研究

分离出一株能利用魔芋飞粉和魔芋精粉生产β-甘露聚糖酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)R10。其摇瓶最适发酵条件为：魔芋飞粉1％(m／m),魔芋精粉2％(m／m),160r/min,37℃培养10h。实验结果表明β-甘露聚糖酶的最适作用温度为60℃,最适作用pH为6．0。魔芋葡甘露聚糖经酶降解后为一系列低聚糖。     

黑曲霉固态发酵生产酸性β-甘露聚糖酶

以黑曲霉WA301为生产菌固态发酵生产酸性β－甘露聚糖酶,较适的培养基组成和培养条件为：麸皮10g,魔芋粉0.4g,豆饼粉1.5g,硫酸铵0.2g,起始湿度55％,pH自然,发酵温度35℃,发酵周期约96h。在此条件下,WA301的酸性β－甘露聚糖酶产率为950U／g干曲左右。     

透明颤菌血红蛋白在发酵工业中的应用概述

透明颤菌血红蛋白在发酵工业中的应用概述郭宏秋,杨胜利（中国科学院上海生物工程研究中心,上海２００２３３）在生物技术日益产业化的今天,特别是随着基因工程技术的飞速发展,为生产新的生物产品带来了可能,有些产品已进人商业化生产,像干扰素、白细胞介素、生长激...