苹果炭疽菌的分子鉴定与检测

测定苹果炭疽菌rDNA全序列,比对苹果炭疽菌和其它炭疽菌ITS序列以及构建系统关系树,发现苹果炭疽菌与胶孢炭疽菌的ITS序列相似性高达99．8％,并与胶孢炭疽菌聚在一起,可以明确苹果炭疽菌应属于胶孢炭疽菌。进一步的序列比对发现,苹果炭疽菌的18S rDNA3’端比其它胶孢炭疽菌多出一段379bp的序列,根据这一特有片段设计引物CgF1与通用引物ITS4配对,结果仅能从苹果炭疽菌中扩增出1232bp的特异性条带。用苹果炭疽菌接种离体苹果,以接种发病的病组织总DNA为模板,利用引物CgF1／ITS4进行PCR扩增,同样可以扩增出1232bp的特异性条带,而健康苹果组织DNA中未能扩增出任何条带,表明该方法可用于苹果炭疽菌的鉴定和快速检测。     

我国不同产区桃褐腐病病原鉴定与分析

【背景】桃褐腐病是桃树的一种重要病害,给桃果生产带来了严重的经济损失。桃褐腐病病原种类较多。【目的】明确我国不同桃产区褐腐病菌的种类。【方法】采集不同产区桃褐腐病果,采用单孢分离法分离病菌,通过形态特征、分子生物学方法和接种试验对分离株进行种类鉴定和分析。【结果】从来自浙江丽水、四川成都、云南昆明、辽宁大连、河北石家庄、北京海淀、山东泰安和山东青岛等8个不同桃产区的褐腐病果上经单孢分离获得15株分离株。各分离株菌落形态略有差异,但来自云南的分离株hfyn与其他分离株明显不同。通过rDNA ITS序列和系统进化树分析,将云南分离株hfyn鉴定为云南丛梗孢(Monilia yunnanensis),来源于其他产区的14株分离株均鉴定为果生链核盘菌(Monilinia fructicola)。采用多对特异性引物PCR扩增分析,确证了上述鉴定结果。接种试验表明,不同产区来源的桃褐腐病菌分离株在桃果上的致病力存在差异,其中来自浙江丽水、河北石家庄、山东青岛的分离株致病力较强,而来自山东泰安和云南昆明的分离株致病力相对较弱。【结论】我国桃产区褐腐病菌主要以M.fructicola为主,但不同产区来源的菌株间存在形态和致病性差异,此结果可为我国桃褐腐病的治理提供科学依据。     

1株产纤维素酶木霉菌种的鉴定

对自行筛选分离的1株木霉菌进行形态学及分子生物学鉴定。采用CTAB法抽提其基因组总DNA,利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增菌株rDNA ITS区序列,扩增产物纯化后进行测序。测序结果在GenBank中进行同源性搜索,并下载部分具有代表性种的ITS序列,利用软件MEGA4构建分子系统发育树,通过序列分析,并结合形态学鉴定该菌属于半知菌亚门,丝孢纲,丛梗孢目,木霉属,康宁木霉(Trichoderma koningii)。     

中国二头孢盘菌属的分类研究（英文）

提供了中国二头孢盘菌属的分类研究概况和已知种类。对属的概念进行了修订;基于形态学特征和序列分析的结果,将兰斯盘菌属的3个种转入二头孢盘菌属,建立3个新组合(黄二头孢盘菌、黄山二头孢盘菌、暗丝二头孢盘菌);描述了一新种(缩孢二头孢盘菌)。该属目前已知的10个种中,在我国分布9个种。编制了该属世界已知种的分种检索表。     

山茱萸不同栽培品种的rDNA ITS序列分析

为测定山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et.Zucc.)核糖体DNA的ITS序列,对山茱萸不同栽培品种进行了ITS序列分析。通过实验筛选出一对引物,进行PCR扩增,对扩增产物提取纯化,双脱氧链终止法DNA测序。然后,利用DNAssist Version 2.0软件加手工校正确定ITS1-5.8S-ITS2序列,并进行ITS序列分析。获得了山茱萸的ITS1-5.8S-ITS2完全序列,ITS1为253bp,5.8S为156bp,ITS2为273bp,总共682bp。7种果型的山茱萸其5.8S基因序列显示高度的一致性,圆柱形果型、长梨形果型、椭圆形果型和纺锤形果型的ITS区序列完全一致,短圆柱形果型在ITS1区3′端及ITS2区5′端各有1个变异位点;短梨形果型在ITS1区5′端有3个变异位点;长圆柱形果型在ITS1区有5个变异位点。结果表明,ITS序列在山茱萸种内比较保守,有的栽培品种之间有较小的差异,此研究为中药山茱萸分子鉴定提供了科学依据。     

山茱萸不同栽培品种的 rDNA ITS 序列分析

为测定山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et.Zucc.）核糖体DNA的ITS序列,对山茱萸不同栽培品种进行了ITS序列分析。通过实验筛选出一对引物,进行PCR扩增,对扩增产物提取纯化,双脱氧链终止法DNA测序。然后,利用DNAssist Version 2.0软件加手工校正确定ITS1-5.8S-ITS2序列,并进行ITS序列分析。获得了山茱萸的ITS1-5.8S-ITS2完全序列,ITS1为253bp,5.8S为156bp,ITS2为273bp,总共682bp。7种果型的山茱萸其5.8S基因序列显示高度的一致性,圆柱形果型、长梨形果型、椭圆形果型和纺锤形果型的ITS区序列完全一致,短圆柱形果型在ITS1区3′端及ITS2区5′端各有1个变异位点;短梨形果型在ITS1区5′端有3个变异位点;长圆柱形果型在ITS1区有5个变异位点。结果表明,ITS序列在山茱萸种内比较保守,有的栽培品种之间有较小的差异,此研究为中药山茱萸分子鉴定提供了科学依据。     

PYTHIUM SYLVATICUM鉴定及其专一性PCR引物

从杭州采集的水稻、棉花和大豆猝倒苗中分离到国内新记录腐霉种Pythium sylvaticum。该腐霉为异宗配合种,菌丝膨大体球形或柠檬形,雄器异丝生,藏卵器光滑,每个藏卵器上1~3个雄器,雄器常在接近藏卵器处形成二叉状分枝,卵孢子不满器。测定了该种4 个菌株的核糖体内转录间隔区(ITS)的序列,根据与59种腐霉ITS序列的比较,设计了P. sylvaticum种专一性引物PSF1和PSR2。实际结果表明:该引物能从11种共14株腐霉DNA中特异性地扩增P. sylvaticum,从而与其它10种腐霉区分。     

基于rDNA ITSl和ITS2序列的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的分子鉴定

本研究测定了褐飞虱 Nilaparvata lugens、白背飞虱 Sogatella furcifera 和灰飞虱Laodelphax striatellus 的rDNA ITSl和ITS2的序列,以探讨这3种稻飞虱的分子鉴定方法.3种飞虱的ITSI和ITS2侧翼区(18S,5.8S和28S)序列相对稳定,但ITS1和ITS2序列在3种飞虱中变异较大.ITS1在所分析的438个位点中可变位点达294个,ITS2在分析的403个位点中可变位点为177个.根据3种飞虱rDNA的ITS1和ITS2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,分析发现3种飞虱ITS1区的特异性引物扩增效果不理想.而ITS2区的特异性引物可以稳定地扩增出明显的目的DNA条带.因此,采用ITS2区的特异性引物可以对3种飞虱进行快速的分子鉴定.     

白菜种传黑斑病菌rDNA ITS区序列分析

本文以来自国内外的20株白菜黑斑病菌及近源种为研究材料,进行了5.8SrDNA及其侧翼ITS区的克隆、测序、序列变异及遗传进化关系分析。黑斑病菌及其近源种真菌核糖体5.8SrDNA及其侧翼ITS区序列比对结果显示,不同种菌株ITS1比ITS2在碱基构成上有更大变异,而且ITS1的序列长度变异比ITS2的大;而种内虽然各菌株的寄主和地理来源不同,但ITS1和ITS2在长度上均没有变异,碱基构成上存在微小的变异。对该区序列的聚类分析表明,白菜黑斑病菌3个种芸薹链格孢Alternariabrassicae、甘蓝链格孢A.brassicicola和萝卜链格孢A.japonica虽然地理来源和寄主不同,但种内的不同菌株均在一个独立的聚类组中,种之间以及其和链格孢属内其它种在聚类关系上能明显分开,可基于该区进行黑斑病菌的分类鉴定。     

1株产漆酶白腐真菌的筛选和鉴定

从不同的生境采集生物样品,利用Bavendamm反应反复筛选产漆酶的白腐真菌。利用真菌通用引物对ITS1/ITS4扩增菌株rDNAITS区序列,对扩增产物进行测序。测序结果在GenBank中进行同源性搜索,下载部分具有代表性种的ITS序列进行序列比对,利用软件MEGA4构建分子系统发育树,通过序列分析,并结合形态学鉴定出4220为香栓孔菌(Trametes suaveolens)。     

基于rDNA ITS1和ITS2序列的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的分子鉴定

本研究测定了褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera和灰飞虱Laodelphax striatellus的rDNA ITS1和ITS2的序列, 以探讨这3种稻飞虱的分子鉴定方法。3种飞虱的ITS1和ITS2侧翼区（18S, 5.8S和28S）序列相对稳定, 但ITS1和ITS2序列在3种飞虱中变异较大。 ITS1在所分析的438个位点中可变位点达294个, ITS2在分析的403个位点中可变位点为177个。根据3种飞虱rDNA的ITS1和ITS2序列设计了特异性引物, 应用特异性引物对样品进行了PCR扩增, 分析发现3种飞虱ITS1区的特异性引物扩增效果不理想, 而ITS2区的特异性引物可以稳定地扩增出明显的目的DNA条带. 因此, 采用ITS2区的特异性引物可以对3种飞虱进行快速的分子鉴定。     

小孢盘菌属种间关系初探（英文）

3个编码蛋白的基因RPB1、RPB2和TEF1以及1个非编码序列28S rD NA的联合分析结果表明,小孢盘菌属位于系统树的上端,形成一个单系群,其中长春小孢盘菌和北京小孢盘菌为姐妹群,它们进一步与该属另3个种(包括该属的模式种)聚类在一起。序列分析结果支持将子囊孢子大小作为小孢盘菌属区分物种的依据,还表明火丝菌科可能不是一个单系群。在参试属中,小孢盘菌属与侧盘菌属的关系较为密切,它们具有极其相似的薄壁子囊,这表明在属的等级上子囊形态可能携带系统发育方面的信息。     

几种尖孢镰刀菌专化型中SIX1、SIX4、SIX6、SIX8同源基因分析

尖孢镰刀菌在与寄主的相互作用中分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白进入木质部中启动致病力,被称为SIX(secreted in xylem)蛋白,为明确其在不同寄主中的作用,本研究比较分析了几种尖孢镰刀菌专化型中SIX1、SIX4、SIX6、SIX8同源基因序列。根据已完成的尖孢镰刀菌古巴专化型1号(Foc1)与4号生理小种(Foc4)全基因组测序序列信息及相关SIX基因序列设计引物,应用PCR方法扩增分析56株尖孢镰刀菌古巴专化型与18株其它专化型及非致病型尖孢镰刀菌菌与其它种或属共21株菌株中的SIX1、SIX4、SIX6、SIX8基因。结果表明:设计的SIX1、SIX4、SIX6、SIX8基因引物均不能从非致病性尖孢镰刀菌与其它镰刀属种或其它属的菌株DNA中扩增出目的条带;SIX1基因的2个引物均能从供试的Foc菌株DNA中扩增出目的条带,同时可从部分其它专化型菌株DNA中扩增出目的条带;SIX4基因引物仅能从供试的尖孢镰刀菌番茄专化型与部分甘蓝专化型菌株DNA中扩增出目的条带;SIX6引物仅能从供试Foc1、Foc2、Foc4菌株DNA中扩增出目的条带;SIX8基因引物能从所有供试的致病尖孢镰刀菌中DNA扩增出目的条带。研究发现的SIX6基因序列提供了快速鉴定尖孢镰刀菌古巴专化型的检测方法,同时为深入研究尖孢镰刀菌各个专化型中SIX基因的功能奠定基础。     

ITS作为粒毛盘菌属DNA条形码的探索

以种内与种间差异以及PCR扩增和测序成功率为评价DNA条形码的重要指标,探索ITS序列作为粒毛盘菌属DNA条形码的可行性。结果表明,ITS成功区分了研究涉及的22个种,其PCR扩增和测序成功率为100%,该片段有望成为该属区分物种的DNA条形码。     

大豆疫霉根腐病菌的rDNA ITS序列分析

采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR扩增了大豆疫霉根腐病菌具有差异的17个菌株的ITSI与ITS2,经过与DL2000的标准分子量DNA进行比较,得到了大约800~1000bp左右的片段,并对PCR产物进行了序列测定。以USA为外类群利用最大简约法构建了大豆疫霉根腐病菌的系统发生树,并分析了菌株之间的遗传进化关系。结果表明:不同菌株ITS1和ITS2在碱基构成上有很大差异,17个菌株大致分为4个谱系中,且来自于同一地区的菌株大都分布在同一谱系中,显示出地理上的差异。     

西瓜枯萎病菌的快速检测与鉴定

通过西瓜枯萎病菌与其他专化型枯萎病菌及瓜类几种重要病原菌的比较基因组分析,获得了西瓜枯萎病菌的基因组特异序列。在此基础上,设计出特异引物,筛选可扩增出西瓜枯萎病菌特异性DNA条带的引物。将特异性引物和尖孢镰刀菌专化型的通用引物W106R/W106S结合,建立双重PCR检测体系。该双重PCR检测体系可以在一次PCR反应中快速、准确的检测出西瓜枯萎病菌,为通过分子方法快速鉴定西瓜枯萎病菌提供技术支持。     

基于环介导等温扩增技术对人乳头瘤病毒的分型检测

目的:利用环介导等温扩增技术(LAMP)对人乳头瘤病毒(HPV)进行快速分型检测。方法:以HPV59、HPV66和HPV68等3种病毒亚型为实验对象,选择合适的特异性核酸序列作为检测的靶序列并构建质粒,针对每个待检靶序列设计若干组扩增引物,并利用构建的质粒筛选出特异性强、灵敏度高的引物组合;将筛选成功的引物加至微流控芯片上,实现人宫颈脱落上皮细胞样本内HPV的快速核酸分型检测。结果:针对HPV59、HPV66和HPV68这3种病毒亚型,设计筛选出具有一定灵敏度的特异性引物,结合微流控芯片,无需对样本进行复杂的核酸提取纯化操作,实现了对临床样本的直接快速检测,整个检测过程在1.5 h内即可完成。结论:LAMP技术可用于临床样本中HPV的分型检测,与微流控芯片结合后操作简单、检测时间短,在临床上有较好的应用前景。     

中国小双孢盘菌属分类研究——7个新种和4个新记录种（英文）

对中国科学院菌物标本馆保藏和近年来采集的我国小双孢盘菌属标本进行了分类研究,鉴定出14个种,包括7个新种(线孢小双孢盘菌、湖北小双孢盘菌、大孢小双孢盘菌、山地小双孢盘菌、蕨生小双孢盘菌、香地小双孢盘菌、中国小双孢盘菌)、4个中国新记录种(碘蓝小双孢盘菌、四孢小双孢盘菌、三隔小双孢盘菌、一个未定名种:Bisporella sp.3999)和3个已报道种。对新种与相似种的主要形态学区别进行了详尽的比较和讨论,更新了部分种在我国的分布状况。提供了该属我国已知种的分种检索表。     

应用PCR法对小麦叶疫病菌的检测

【背景】小麦叶疫病菌于20世纪60年代入侵我国后,迅速传播扩散并在局部区域造成严重危害,对我国小麦的健康发展构成了巨大威胁。【方法】设计出检测小麦叶疫病菌的特异性引物,建立快速检测该病菌的PCR方法。用真菌通用引物ITS4/ITS5对小麦叶疫病菌进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆和测序,使用DNAMAN软件设计出检测该病菌的特异性引物LJY1和LJY2,优化PCR反应体系。【结果】建立了该病菌的PCR检测方法,PCR反应体系:25 mmol·L-1Mg Cl22.5μL,10 mmol·L-1d NTP 1.0μL,10μmol·L-1引物各0.5μL,DNA模板8 ng,最佳退火温度57.6℃。【结论与意义】该方法可以准确地将小麦叶疫病菌与其他链格孢属的真菌区分开。本研究结果为小麦叶疫病的快速检测提供了依据,能够有效防止该病菌在小麦进出口贸易中传入我国。     

中国盘菌目新记录属和种

吉林省盘菌标本的研究中发现1个中国新记录属：威氏盘菌属Wilcoxina,3个中国新记录种：威氏盘菌Wilcoxina mikolae,淡蓝盘菌Peziza saniosa及达德利肉杯菌Sarcoscypha dudleyi,并提供形态特征描述,生境照片、显微结构线条图以及ITS序列的GenBank号。