运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

敲除ESR1基因对人乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的:建立CRISPR/Cas9系统用于敲除人源雌激素受体α(ERα)基因(ESR1),并利用此细胞模型初步检测ESR1基因对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。方法:设计一个靶向人源ESR1基因第2外显子的单向导RNA(sg RNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人乳腺癌细胞株MCF-7,Western印迹检测MCF-7中ESR1基因的敲除效果,通过Transwell、反向侵袭试验观察ESR1基因敲除后对细胞侵袭能力的影响。结果:测序结果显示靶向ESR1基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;Western印迹显示Cas9-ERα组的MCF-7细胞内ERα表达水平较对照组显著降低;Tanswell、反向侵袭试验证实ESR1基因敲除能够促进乳腺癌细胞的侵袭能力。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向ESR1基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除ESR1基因;ERα能够抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。     

利用CRISPR/Cas9n系统敲除人源SNF5基因

目的:建立敲除人源基因组中SNF5基因的CRISPR/Cas9n系统。方法:设计一对靶向人源SNF5基因第1个外显子的sg RNA,分别克隆至p X461、p X462表达载体后,转入人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测细胞株中SNF5基因的敲除效果。结果:测序证明构建的靶向SNF5基因CRISPR/Cas9n重组质粒与设计吻合。Western印迹结果显示,重组质粒p X461-h SNF5sg RNA转染293T细胞后24 h,细胞内SNF5表达水平明显降低;重组质粒p X462-h SNF5sg RNA转染293T细胞后48 h,细胞内SNF5表达水平显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9n系统获得了靶向SNF5基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除SNF5基因的表达。     

Cas9蛋白对亲骨转移人乳腺癌细胞株生物学性质和超微结构的影响

目的：构建表达Cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株,并研究Cas9蛋白的表达对细胞生物学性质和超微结构的影响,为利用CRISPR/Cas9技术研究乳腺癌骨转移分子机制提供实验基础。方法：通过慢病毒载体介导Cas9蛋白基因转染亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO,通过G418筛选转染细胞,采用流式细胞术、Western blot、免疫细胞化学验证Cas9基因转染是否成功;运用实时无标记动态细胞分析技术和细胞划痕实验检测Cas9蛋白表达对细胞增殖及迁移的影响;透射电镜观察Cas9蛋白表达对细胞超微结构的影响。结果：成功构建稳定表达Cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO-Cas9,Cas9蛋白的表达对细胞的增殖、迁移和超微结构无明显影响。结论：MDA-MB-231BO-Cas9细胞可用于CRISPR/Cas9技术进一步研究。     

沉默MDR1基因表达逆转肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性

本研究以A549/DDP细胞为实验对象,利用shRNA(short hairpin RNA)沉默MDR1基因,逆转人肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。构建3种靶向MDR1基因重组干扰载体,稳定转染A549/DDP细胞,qRT-PCR检测MDR1 mRNA表达水平,Western blotting检测MDR1蛋白表达水平,MTT法检测细胞对顺铂的敏感性。结果显示成功构建了3种靶向MDR1的重组表达载体p2.1-1、p2.1-2和p2.1-3。3种干扰表达载体均能有效沉默A549/DDP细胞MDR1基因表达,其中p2.1-3对MDR1沉默效果最好,对mRNA和蛋白的沉默效率分别为51.47%和53.24%。转染p2.1-3的细胞对顺铂的IC50由(72.08±7.00)μmol/L降至(31.89±3.39)μmol/L,逆转率达到(67.60±5.70)%。这些结果表明靶向MDR1的重组干扰载体均能够有效抑制MDR1表达,其中p2.1-3干扰效果最佳并且能逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。     

利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除稳定细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除的细胞株,研究α-ENaC基因对细胞增殖的影响。构建敲除α-ENaC基因的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,通过转染和嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株,Western Blot、测序确定突变的细胞株,CCK-8检测突变细胞株的增殖活力。成功构建靶向α-ENaC基因第一外显子的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,嘌呤霉素筛选后,挑选8个单细胞克隆中有两个单细胞克隆α-ENaC蛋白表达下降,一个单细胞克隆α-ENaC蛋白不再表达,测序结果显示3个单细胞克隆分别为2个单等位基因突变和1个双等位基因突变,且未发现脱靶现象。突变细胞株的增殖活力降低,其中双等位基因突变细胞株增殖活力降低更为显著。因此,利用CRISPR/Cas9结合SSA-RPG报告载体成功获得了α-ENaC基因敲除的L2细胞株,α-ENaC与细胞增殖有关。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建敲除TSPAN4基因的非小细胞肺癌细胞系

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除TSPAN4基因,构建TSPAN4基因稳定敲除的非小细胞肺癌A549细胞株,并检测其对A549细胞迁移、侵袭能力的影响,为后期探讨迁移体在非小细胞肺癌转移过程中的作用提供实验基础。以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(px459)为载体,与设计好的引物连接后得到敲除载体px459-sgRNA-TSPAN4。以jetPRIME?为转染试剂,将构建好的质粒转染至A549细胞系,嘌呤霉素筛选单克隆细胞株并使用Western blot实验鉴定A549细胞系中TSPAN4基因的敲除效果,细胞划痕实验和Transwell实验检测敲除TSPAN4基因对A549细胞迁移、侵袭能力的影响。该研究成功构建了TSPAN4基因编辑质粒px459-sgRNA-TSPAN4。Western blot结果显示敲除TSPAN4基因能够显著降低A549细胞株中TSPAN4蛋白表达量;敲除TSPAN4基因对A549细胞迁移、侵袭能力的影响在统计学上无显著性差异,降低了N-cadherin的表达,对E-cadherin表达的影响不大。以上研究表明,使用CRISPR/Cas9...     

维甲酸受体β基因RNAi表达质粒的构建及其对A549细胞增殖和分化的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术,构建针对维甲酸受体（RAR）β基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,诱导RARβ基因沉默,并观察其对肺癌细胞A549株的细胞周期和增殖的影响。方法：依据设计siRNA的原则。针对人RARβ的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSUPER-NEO-GFP真核表达载体中构建重组体pSUPER-RAR[β转染至A549细胞中,以空质粒和RARβ高表达质粒转染为对照,用Western印迹检测RARβ基因的表达,并采用M1Tr试验检测转染后细胞株的增殖和细胞分化情况。结果：表达人类RARβ基因的siRNA重组表达质粒构建成功;MTT试验结果表明,转染的A549-RARβ-si细胞增殖能力降低。结论：采用RNAi技术特异阻断RARB基因表达,通过转染A549细胞,可使其细胞形态发生变化,并抑制其细胞生长。     

基于CRISPR/Cas9技术构建Cyr61敲低HEK293T稳定细胞株及其生物学功能检测

为了探讨Cyr61的生物学功能,该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Cyr61敲低的HEK293T稳定细胞株,并在体外研究Cyr61对HEK293T细胞增殖和凋亡的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,应用http://crispr.mit.edu/在线设计3条Cyr61的导向RNA(guideRNA,gRNA),用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-gRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,经筛选后包装成Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒,利用Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒和HDR质粒转染HEK293T细胞,加入嘌呤霉素(8μg/mL)进行筛选,通过实时荧光定量PCR技术及蛋白质免疫印迹(Western blot)鉴定出HEK293T敲低Cyr61细胞株;常规培养细胞,利用细胞计数检测试剂盒(CCK8)检测细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞凋亡情况。该研究成功构建出Cyr61敲低HEK293T细胞株,与对照组相比,Cyr61敲低细胞株的增殖明显升高(P0.05),凋亡率明显减少(P0.05)。通过CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建Cyr61敲低HEK293T稳定细胞株,为研究Cyr61基因提供了有效的工具。     

MEKK3稳定表达细胞株的建立及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建人MEKK3基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对肺腺癌细胞增殖的影响.方法 从A549细胞中提取总RNA,应用RT-PCR扩增MEKK3 cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/hygro（＋）质粒中,构建成MEKK3基因的真核表达载体,然后转染入人肺腺癌A549细胞中,潮霉素筛选稳定转染克隆,通过MTT实验,研究转染MEKK3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误,Western印迹检测结果显示MEKK3基因在A549细胞中具有良好的表达;荧光实时定量PCR结果表明MEKK3基因在其稳定转染的A549细胞克隆中表达上调,与空载体稳定转染及未转染细胞比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MTT结果显示MEKK3表达上调的稳定克隆组,A549细胞的增殖活性显著增强（A570=0.876 1±0.074 5）,明显高于空载体稳定转染组（A570=0.582 8±0.070 3）及未转染亲代细胞组（A570=0.584 9±0.035 2）,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 MEKK3表达上调可导致肺腺癌细胞的增殖增强.     

应用CRISPR/Cas9系统下调长链非编码RNA HOTAIR

近来CRISPR/Cas9系统作为一种成熟的基因编辑工具,被广泛应用。然而由于长链非编码RNA特殊的结构,该系统针对其研究的报道并不多见。选取与肿瘤生成、发展密切相关的长链非编码RNA HOTAIR为研究对象,通过构建Cas9核酸酶稳定遗传表达细胞株,建立pg RNA文库,对其进行基因敲除。q RT-PCR结果显示,pg RNA/Cas9系统靶向HOTAIR基因可使其表达下调60%。MTT增殖检测及细胞划痕实验结果表明:此系统介导的HOTAIR下调可明显抑制He La细胞的增殖与迁移。同时,肿瘤抑制因子p21、p53、p RB和DLC1转录水平的变化也暗示,HOTAIR对细胞功能的影响与其调控相关肿瘤抑制因子之间存在紧密联系。因此,利用Cas9技术抑制HOTAIR的表达对全面了解其功能具有重要意义。     

利用CRISPR/Cas9技术构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株及其功能鉴定

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人肝癌细胞HepG2中的四个半LIM结构域蛋白1(FHL1)基因,构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别FHL1基因第三外显子相关序列的上下游小向导RNA,构建真核重组表达质粒,测序鉴定后,将重组质粒包装慢病毒感染HepG2细胞,用嘌呤霉素抗性筛选稳定敲除FHL1基因的细胞株,用免疫印迹法鉴定HepG2细胞中FHL1基因的敲除效果,利用生长曲线实验和划痕实验检测基因敲除对细胞生长和迁移的影响。结果:筛选出敲除FHL1基因的HepG2细胞株,且FHL1基因敲除显著促进细胞的增殖和迁移。结论:利用CRISPR/Cas9技术获得了内源FHL1基因敲除细胞株,初步实验提示敲除FHL1基因可以促进肝癌细胞增殖和迁移,为后续研究FHL1在肝癌中的功能奠定了基础。     

CDK4基因沉默对非小细胞肺癌A549 增殖和代谢的影响

目的:通过特异性小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),使CDK4基因沉默,探讨该基因沉默对肺癌A549细胞增殖和代谢的影响及其可能的作用机制。方法:将靶向CDK4小干扰RNA(si RNA-CDK4)和阴性对照干扰片段(si RNA-control)成功转染A549细胞后,利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分别检测CDK4在m RNA和蛋白水平的变化;细胞计数法、CCK-8法和软琼脂糖克隆形成实验检测A549增殖的变化和克隆形成能力;FCM法检测A549细胞的细胞周期;18F-FDG摄取实验、乳酸检测试剂盒及海马技术检测A549细胞中葡萄糖、乳酸的量及氧耗的变化;利用RT-PCR检测CDK4基因沉默后A549细胞中糖代谢相关酶m RNA水平的变化。结果:将靶向CDK4小干扰RNA(si RNA-CDK4)转染A549细胞后,可明显抑制CDK4的m RNA和蛋白表达(P0.001,P0.01)。CDK4蛋白抑制后,细胞增殖在48、72和96 h均明显降低(P值均0.05),G1期细胞比例明显增多,S期细胞比例明显减少(P值均0.05);18F-FDG摄取量下降(42.21±1.90)%(P0.05),乳酸的生成量减少(29.39±5.35)%(P0.05),而细胞的基础耗氧量增加(67.17±3.58)%(P0.01);糖酵解相关酶PFKFB3、PKM2、LDHA在m RNA水平均明显减低(P0.001,P0.01,P0.001)。结论:抑制CDK4表达可明显降低糖酵解水平,并增加耗氧量;同时可引起细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞增殖。其机制可能与CDK4直接或间接调节糖酵解相关酶的表达有关。     

利用CRISPR/Cas9n double nick系统构建人DNAH2基因敲除的U2OS细胞株

基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2(Homo sapiens dynein,axonemal,heavy chain 2)基因敲除的U2OS稳定细胞株,旨在研究DNAH2基因的生物学功能。首先设计并合成A、B两个sg RNA(Single guide RNA)以及各自的互补链,退火连接形成DNAH2 sg RNA-A、B双链,再分别与带有BbsⅠ粘性末端的p X462线性载体相连,形成p X462-DNAH2-A、p X462-DNAH2-B重组真核表达质粒。质粒共转染至U2OS细胞后,加入嘌呤霉素,以有限稀释法获得阳性单克隆细胞株,再以蛋白印迹实验检测DNAH2蛋白的表达,最后通过PCR-基因测序技术分析突变特点。结果显示A、B sg RNA双链成功插入p X462载体,U2OS-DNAH2-KO单克隆细胞株中DNAH2蛋白不表达,DNAH2基因发生移码突变,从而证实利用CRISPR/Cas9n double nick系统成功构建人DNAH2基因敲除的U2OS稳定细胞株,为研究DNAH2基因提供有利工具。     

应用CRISPR/Cas9系统构建MTHFD1基因敲除的HEK-293细胞系

目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1, MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系。方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sg RNA),然后合成sg RNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的m RNA和蛋白表达水平。结果:重组载体中含有正确的sg RNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在m RNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系。     

CRISPR/Cas9系统敲除TET2基因对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

为了进一步探讨TET2蛋白在肝癌的发生发展过程中发挥的生物学功能,本研究使用CRISPR在线设计工具(http://crispr.mit.edu/),针对TET2的外显子设计g RNA,构建靶向TET2基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,转染HepG2细胞。T7E1酶切检测TET2基因的编辑效率,Western blotting检测TET2蛋白表达水平;MTT法、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒分别检测HepG2细胞的增殖活性及凋亡水平的改变。T7EI酶切分析显示敲除效率为31.4%;TET2基因表达量的降低抑制了HepG2细胞的增殖,促进了细胞的凋亡。CRISPR/Cas9质粒系统能够在细胞水平对TET2基因进行编辑,靶向TET2基因的CRISPR/Cas9质粒系统降低了TET2的表达、抑制HepG2细胞的增殖、促进HepG2细胞的凋亡。本研究表明CRISPR/Cas9技术为研究TET2的功能和作用机制提供了有效工具,为研究TET2蛋白在肝癌的发生发展过程中发挥的生物学功能提供实验依据。     

Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。     

沉默MDR1基因逆转SGC7901/ADM细胞对紫杉醇的耐药性

本研究利用短发夹sh RNA(short hairpin RNA)沉默SGC7901/ADM细胞MDR1基因,从而逆转SGC7901/ADM细胞对紫杉醇的耐药性。根据MDR1基因序列设计并合成编码sh RNA的DNA模板,构建3种靶向MDR1基因重组干扰载体,稳定转染SGC7901/ADM细胞,q RT-PCR检测MDR1 m RNA表达水平,Western blotting检测MDR1蛋白表达水平,MTT法检测细胞对紫杉醇的敏感性。结果表明,成功构建了靶向MDR1基因的3种重组表达载体,分别转染SGC7901/ADM细胞后均能不同程度沉默MDR1基因的表达,其中p2.1-3对MDR1沉默效果最好,m RNA和蛋白的沉默效率分别为78.5%和45%。紫杉醇对细胞的IC50值由(3.147±0.494)μmol/L降至(0.714±0.059)μmol/L,逆转率达到(78.22±1.906)%。结果表明,靶向MDR1的干扰表达载体能够抑制MDR1基因的表达,从而逆转SGC7901/ADM细胞对紫杉醇的耐药性。     

构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。     

FKBP12真核表达载体的构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的:构建FK506结合蛋白12(FK506 binding proteins 12,FKBP12)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法:RT-PCR扩增人平滑肌细胞FKBP12基因片断,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12真核表达载体,经琼脂糖电泳、特异性内切酶切割及测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,HygromycinB筛选建立稳定转染的细胞株,免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果:构建了FKBP12真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达FKBP12蛋白。结论:FKBP12真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为深入研究基于FKBP12靶点药物的机制奠定基础,进而为探索安全、高效的免疫抑制剂提供新的途径。