细菌纤维素酶的酶学性质研究

对纤维素酶各组分的酶学性质进行研究,是提高生物法利用纤维素效率的关键。本研究以实验室筛选得到的产纤维素酶细菌为出发菌株,对其发酵粗酶液的纤维素酶酶学性质进行研究。以羧甲基纤维素钠为底物,所测内切葡聚糖苷酶活力为15.4 IU/ml,酶促动力学常数Km和Vmax分别为0.67 mg/ml和0.62 mg(ml·min)-1,以微晶纤维素为底物,其外切葡聚糖苷酶活力为29.9 IU/ml,酶促动力学常数Km和Vmax分别为0.95 mg/ml和0.38mg(ml·min)-1。两种酶的最适反应温度与p H相同,分别为55℃和p H7.2。     

镰刀菌Q7-31T金属蛋白酶FQME14的分离纯化及鉴定

从镰刀菌Q7-31T燕麦秸秆诱导发酵的粗酶液中分离、纯化并鉴定金属蛋白酶。研究该蛋白酶的酶学特性,丰富和完善金属蛋白酶的基础资料;探究其在纤维素酶系降解纤维素过程中发挥的作用,旨在丰富和完善纤维素酶系降解机制。以燕麦秸秆为碳源诱导发酵镰刀菌Q7-31T,并在发酵第6天收酶。通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-100凝胶过滤层析和DEAE弱阴离子交换层析对粗酶液进行分离纯化得到金属蛋白酶,随后对其进行了酶学性质分析和串联质谱鉴定。结果显示,从镰刀菌Q7-31T菌株的粗酶液中分离得到一种蛋白酶FQME14,其相对分子质量为30 k D;串联质谱鉴定的结果表明FQME14属于M14家族;蛋白酶酶学性质研究表明:该蛋白酶的比酶活为2.85 U/mg,最适反应p H和温度分别为p H 7.0和40℃,在p H 5.0-p H 9.0的范围内具有很好的稳定性,蛋白酶在50℃以下稳定性很好,超过50℃酶活力降低。该蛋白酶对酪蛋白、卵清蛋白和牛血清白蛋白都有很高的降解能力。金属离子Mn~(2+)和Co~(2+)对酶活性有激活作用,Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、K~+、Ca~(2+)和Na~+对酶活性有不同程度的抑制作用。从镰刀菌Q7-31T粗酶液中分离纯化得到蛋白酶FQME14,并对其进行了酶学性质的研究和串联质谱鉴定,结果表明FQME14为M14家族蛋白酶,是一种新的金属蛋白酶。     

温度和pH对橄榄蚶消化酶活性的影响

采用酶学分析方法,测定了温度和pH对橄榄蚶蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶活力的影响。结果表明:温度和pH显著影响橄榄蚶蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活力;蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的最适温度分别为60℃、40℃和30℃～40℃,最适pH分别为3.6、5.2和6.0。橄榄蚶3种消化酶活性大小为淀粉酶>蛋白酶>纤维素酶。     

一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及酶学特性研究

从采集的含腐烂树叶的土壤中,筛选到1株产纤维素酶能力较高的菌株JJ-3,经16S r RNA基因序列分析,鉴定该菌株为产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca)。产酶条件及酶学特性研究表明:以滤纸为碳源、蛋白胨为氮源、初始p H为8.0的培养基中发酵3 d更利于纤维素酶的合成;菌株发酵液在中性和碱性条件下均有较高的滤纸酶活力,分别可达118.7 U/m L(p H7.0),167.8 U/m L(p H8.0)和120 U/m L(p H9.0);所产纤维素酶的最适酶反应p H为7.0,最适酶反应温度为40℃,对温度比较敏感,在p H7.0-8.0的范围内具有较好的稳定性,能满足中性和碱性纤维素酶的要求。     

根霉TC1653产纤维素酶提纯及酶学性质研究

对根霉所产纤维素酶酶系进行了分析并研究了部分酶学性质。实验选择超滤和凝胶柱分离相结合的方式提纯纤维素酶,结果显示根霉TC1653纤维素酶系是一个完全酶系,具有一个较为明显的内切葡聚糖酶组分。β-葡萄糖苷酶组分的最适反应温度为70℃,温度高于70℃时,活性迅速下降,但在这种高温下具有最高反应活性的酶很少见,很可能又是一种新的β-葡萄糖苷酶。     

洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1产脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究

旨在对洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)Lu10-1产脂肪酶的发酵条件及酶学性质进行研究。通过单因素和正交实验探讨了碳源、氮源、诱导物、初始p H值、温度等主要发酵参数的影响,并初步考察了温度、p H、金属离子和有机溶剂等对其催化反应的影响。结果表明,B.cepacia Lu10-1产脂肪酶最佳培养基组成和发酵参数为:可溶性淀粉1.5%,蛋白胨1.5%,橄榄油3 g/L,K2HPO4 2 g/L,发酵温度32℃,初始p H 9.0,培养48 h酶活达12.4 U/m L,比初始酶活提高了2.7倍。酶的最适温度和p H值分别为60℃和9,在60℃以下保持100 h酶活仍保持在80%以上,在p H5.0-10.0之间活性稳定,对甲醇、乙醇等有机溶剂耐受性好。     

绿色木霉耐热β-葡萄糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

旨在对绿色木霉-葡萄糖苷酶进行分离纯化并研究其酶学性质。对绿色木霉GIM3.139进行摇瓶发酵,经离心超滤和Sephadex G-200凝胶层析,得到纯化后的β-葡萄糖苷酶,并研究其酶学性质。结果显示,分离纯化组分经PAGE电泳检测达到电泳纯,研究发现,该酶最适反应温度为80℃,热稳定性好,在70-95℃时能长时间保持较高活力,最适p H值为6.5,耐酸碱稳定性好。金属离子中,Fe3+、Mg2+、K+对β-葡萄糖苷酶的活性起抑制作用,其中Fe3+对该酶的抑制作用最为明显,Fe2+、Mn2+对β-葡萄糖苷酶的活性起激活作用,其中Mn2+对β-葡萄糖苷酶的激活作用最为明显。有机溶剂中,甲醇、丙酮对该酶起到激活作用,其中甲醇的激活作用最明显,而乙酸乙酯对该酶具有明显的抑制作用。分离纯化得到了电泳纯的β-葡萄糖苷酶,并掌握了其基本的酶学性质。     

康宁木霉QF-02纤维素酶酶学性质的研究

对康宁木霉QF-02生产的纤维素酶的一般酶学性质进行了研究。该纤维素酶系中滤纸酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、β-葡萄糖苷酶的最适作用温度分别为55℃、65℃、50℃和70℃,最适作用pH为4.0-5.0;在40-50℃范围内热稳定性较好,24 h保温后的残留酶活在48.5%以上;在pH3.0-8.0范围内比较稳定,4℃保存24h后的残留酶活在75.7%以上。与几种商品纤维素酶相比,该纤维素酶对未处理和碱预处理稻草都表现出较强的糖化能力。     

低温几丁质酶基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达及酶学性质表征

【目的】通过构建假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)低温几丁质酶(chitinaseA,chi A;chitinase C,chi C)的重组乳酸克鲁维酵母菌株、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质表征,为低温几丁质酶潜在工业化生产几丁寡糖奠定理论基础。【方法】人工合成密码子优化的几丁质酶基因,构建重组乳酸克鲁维酵母表达质粒(p KLAC1-chi A、p KLAC1-chi C)并用电脉冲法转化到乳酸克鲁维酵母中,实现低温几丁质酶的可溶表达。利用镍柱亲和层析纯化得到高纯度的重组几丁质酶。【结果】成功构建产低温几丁质酶的重组乳酸克鲁维酵母并纯化获得高纯度的重组几丁质酶。经SDS-PAGE分析在110 k Da与90 k Da附近出现符合预期大小的蛋白条带。铁氰化钾法测得Chi A和Chi C的酶活分别为51.45 U/mg与108.56 U/mg。最适反应温度分别为20°C和30°C,最适p H分别为8.0和9.0。在低于40°C,p H 8.0–12.0时,Chi A和Chi C重组酶较稳定。Chi A和Chi C对胶体几丁质以及粉状底物α-几丁质与β-几丁质具有明显的降解活性,且具有一定协同降解能力。【结论】首次实现假交替单胞菌来源的低温几丁质酶在乳酸克鲁维酵母中的重组表达、纯化、酶学性质及其降解产物分析,为其他低温几丁质酶的研究提供借鉴意义。     

果胶裂解酶产生真菌的选育及酶学性质研究

果胶裂解酶(pectin lyase)具有降解果胶物质的能力,在工业、医药等领域有着重要作用,目前主要由果胶裂解酶功能菌株进行工业发酵生产,但现已开发的能用于工业生产的菌株资源十分有限。本实验采用刚果红染色法从雅安果园富含果胶土壤中筛选果胶裂解酶产生菌株,旨在为果胶裂解酶工业生产开发新的菌株资源。实验最终筛选出一株果胶裂解酶产生真菌菌株,经形态学和分子生物学鉴定为丛梗孢目曲霉属(Aspergillus monilia)的黄曲霉(Aspergillus flavus)。发酵条件研究表明,其最佳培养基的组成为(g/L):桔皮粉3,麸皮5,K_2HPO_4 0.05,Mg SO40.05,在此组合下酶活可达1.48 U/m L;最适培养条件为:初始p H 8.0,接种量8%,温度30℃,摇床转速200 r/min,培养时间48 h。酶学性质研究表明:该酶的最适p H为8.0,在p H 7.0~9.0范围内稳定性良好;最适温度为50℃,在40~50℃范围内稳定性较好;Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶有较明显的激活作用,Mn~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)等对酶有不同程度的抑制作用。本研究成功对筛选菌株进行了发酵条件优化、酶学性质的研究,为果胶裂解酶工业生产菌株的选育以及实际应用提供实验依据。     

有机磷农药降解菌YC-YH1中mpd和ophc2的克隆及酶学性质分析

从一株有机磷农药降解菌施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri YC-YH1中克隆到两个有机磷水解酶基因mpd和ophc2。将两个基因分别连接到表达载体p ET-32a并克隆到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;利用Ni亲和层析柱纯化甲基对硫磷水解酶(MPH)和有机磷水解酶(OPHC2),并进行了酶学性质分析。MPH最高活力的反应温度为40℃,在p H8-12范围内,酶表现出较高的活力。OPHC2酶的最适反应温度为30℃,在p H 8-12的范围内酶活力较高。两种酶按1?1比例混合组成的混合酶在30-40℃范围内酶活力很高,达95%以上,混合酶在p H范围为8-12内仍具有较高的活力。多种金属离子会对酶的活性产生一定影响,酶对SDS和EDTA都有很高的敏感度,混合酶能够降低对金属离子的敏感性。     

海洋来源琼胶酶的分离纯化及酶学性质研究

采用Vibiro sp.ZC-1发酵制备琼胶酶,粗酶液经过中空纤维柱浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE-阴离子交换层析,得到一个电泳纯的琼胶酶组分Aga ZC-1,其分子质量约为45k Da,比活力为114.613U/mg。对Aga ZC-1进行酶学性质分析,结果表明,其最适反应p H为7.0,在p H为5.0~9.0时保温1h仍能保持80%以上的酶活力;最适反应温度为50℃,在45℃条件下保温1h酶活力保持在60%以上。在高浓度(5mmol/L)下,Fe~(3+)、Cu~(2+)、Sn~(2+)和Zn~(2+)能完全抑制琼胶酶的活性,在低浓度(1mmol/L)下,Cu~(2+)、Ba~(2+)、Na~+、Zn~(2+)、Ag~+、Sr~(3+)、K+对琼胶酶活性具有明显抑制作用。琼胶酶的动力学参数K_m和V_(max)分别为0.538mg/ml和6.33μmol/(L·min),对琼胶底物具有高度专一性,降解产物主要为新琼四糖和新琼六糖。     

竹叶青Trimeresurus stejnegeri蛇毒凝血酶样酶的酶学性质研究

本文报道从竹叶青蛇毒中纯化的两个凝血酶样酶(组分Ⅰ和组分Ⅱ)的酶学性质研究。结果表明二者在体外都能使人纤维蛋白原转变为纤维蛋白,具有精氨酸酯酶活性,都能水解凝血酶专一性底物。纤维蛋白平板法证明组分Ⅰ具有激活纤溶作用;组分Ⅱ同时具有激活纤溶和直接纤溶作用;组分Ⅰ和组分Ⅱ能缓慢降解纤维蛋白原的α链,随着作用时间延长,组分Ⅰ还能进一步部分降解纤维蛋白原的β链,活性中心探讨表明,组分Ⅰ的活性中心由丝氨酸蛋白酶部位和糖基部位组成。组分Ⅰ水解BAEE的最适温度为50℃,最适pH为8.6。     

竹叶青Trimeresurus stejeegeri蛇毒凝血酶样酶的酶学性质研究

本文报道从竹叶青蛇毒中纯化的两个凝血酶样酶（组分Ⅰ和组分Ⅱ）的酶学性质研究。结果表明二者在体外都能使人纤维蛋白原转变为纤维蛋白,具有精氨酸酯酶活性,都能水解凝血酶专一性底物。纤维蛋白平板法证明组分Ⅰ具有激法纤溶作用;组分Ⅱ同时具有激活纤溶和直接纤溶作用;组分Ⅰ和组分Ⅱ能缓慢降解纤维蛋白原的α链,随着作用时间延长,组分Ⅰ还能进一步部分降解纤维蛋白原的β链,活性中心探讨表明,组分Ⅰ的活性中心由丝氨酸蛋白酶部位和糖基部位组成。组分Ⅰ水解BAEE的最适温度为50 ℃,最适pH为8.6。     

半夏内生真菌所产β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究

从半夏中分离筛选得到一株植物内生真菌,提取培养液中的β-葡萄糖苷酶,研究其酶学特性。结果表明:该菌种所产β-葡萄糖苷酶的最适反应温度在45~50℃之间,最适p H在7~8之间;在低于40℃条件下,p H为6~9时,酶活较稳定;其最适反应时间为40 min,金属离子和有机溶剂对酶活性影响都很大,在最适反应条件下其酶活为(77.83±0.42)U/m L。     

地衣芽孢杆菌TG116胞外蛋白酶产酶条件与酶学性质

【背景】从独角莲中分离得到的地衣芽孢杆菌TG116是一株对植物病原菌具有广谱抗性作用的生防菌株。【目的】优化TG116的产酶条件并探索其酶学性质,进一步了解其抗菌机制。【方法】采用Folin-Phenol显色法与响应曲面法,优化菌株TG116的产酶条件并研究其蛋白酶的酶学性质。【结果】菌株TG116产酶最适条件为:温度40.83°C,p H 8.01,发酵时间53.74 h,增加通气量可以显著提高酶活力。按照优化后的条件培养48 h后,上清液蛋白酶活力从57.46 U/mL达到了254.07 U/mL。酶学性质研究表明:该酶为碱性蛋白酶,最适反应pH为8.5,最适反应温度为50°C,具有良好的温度和pH稳定性,EDTA对酶活具有强烈的抑制作用,金属离子Mg~(2+)、Ca~(2+)、Na~+、Co~(2+)、K~+等对酶活也具有一定的抑制作用。【结论】菌株TG116具有良好的p H与温度稳定性,在实际应用中蛋白酶不易失活,可以分解真菌的细胞壁蛋白成分,破坏细胞壁结构,从而抑制甚至杀死病原菌,达到抗菌作用。     

红树林微生物DH-2胞外蛋白酶的性质及产酶条件优化

从大亚湾红树林土壤样品中分离得到产蛋白酶菌株,鉴定所产胞外蛋白酶的酶学性质以及菌株的最佳发酵培养条件。采用平板透明圈法筛选菌株,福林酚显色法测定蛋白酶的酶活,通过单因素和正交试验确定其最佳发酵培养基以及发酵条件。从壤样品中分离得到一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌DH-2,该菌株分泌的蛋白酶最适反应pH和温度分别为8.0和65℃,50℃保温处理60 min后,剩余酶活仍保留80%以上。该蛋白酶对多种金属离子、有机溶剂及表面活性剂均有较好的耐受性。确定该菌株产蛋白酶的最适条件:1%(m/V,下同)可溶性淀粉,1%胰蛋白胨、1%NaCl,初始pH 5.5及7%的接种量,40℃培养36 h。在最适条件下测得其发酵液的酶活为236.30 U/mL,约为初筛时的酶活的8倍。该蛋白酶具有较为广阔的作用温度和pH范围,金属离子、有机溶剂及表面活性剂耐受性好,酶的性质比较稳定。     

产碱性纤维素酶兼性厌氧菌株的筛选和酶学性质的初步研究

用CMC平板筛选方法,从造纸厂碱性土壤中获得产碱性纤维素酶兼性厌氧菌株LZ-5,革兰氏阴性,经鉴定为弧菌属(Vibrio sp.)中的一个种.液体摇瓶培养产生碱性纤维素酶活力高达5.8 U/mL.酶学性质初步研究显示,LZ-5产生的纤维素酶最适反应温度为40℃,最适反应pH值为9.0,在碱性条件下具有较高的酶活性和较好的稳定性.经传代培养证实该菌株遗传性能稳定.     

产碱性纤维素酶兼性厌氧菌株的筛选和酶学性质的初步研究

用CMC平板筛选方法, 从造纸厂碱性土壤中获得产碱性纤维素酶兼性厌氧菌株LZ-5, 革兰氏阴性, 经鉴定为弧菌属(Vibrio sp.)中的一个种。液体摇瓶培养产生碱性纤维素酶活力高达5.8 U/mL。酶学性质初步研究显示, LZ-5产生的纤维素酶最适反应温度为40℃, 最适反应pH值为9.0, 在碱性条件下具有较高的酶活性和较好的稳定性。经传代培养证实该菌株遗传性能稳定。     

枯草杆菌蛋白酶的纯化及酶学性质

本文利用实验室保存的枯草杆菌发酵产生枯草杆菌蛋白酶,并经(NH4)2SO4盐析和CM-sepharose Fast Flow对枯草杆菌蛋白酶进行纯化,用SDSPAGE检测纯化效果,显示该酶分子量低于14kDa,并对蛋白酶的酶学性质、体外溶栓特性及溶栓机理进行初步探讨,其最适反应温度为60-70℃,但50℃以下稳定性良好,最适反应pH为7,pH6-8稳定。