小鼠脂肪来源干细胞体外培养、诱导分化及鉴定

目的:观察C57小鼠ASCs (Adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养的生物学特性,探讨其成脂成骨诱导分化能力.方法:无菌条件下切取C57小鼠腹股沟处脂肪组织,0.25％Ⅰ型胶原酶消化,分离培养ASCs,37℃,5％CO2饱和湿度孵箱培养,细胞融合达80％时消化传代.观察其细胞形态;MTT比色法测细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第2代细胞行成骨及成脂诱导培养,3周后分别茜素红染色和油红O染色鉴定.结果:从C57小鼠脂肪组织中分离获取的ASCs呈长梭形,成纤维细胞样.细胞生长曲线呈“S”型,证明ASCs具有很强的增殖能力;流式细胞术分析结果:CD29、CD44、CD90阳性表达,CD31、CD34、CD45阴性表达;成骨诱导后茜素红染色阳性,成脂诱导后油红O染色阳性.结论:本试验分离培养的细胞为ASCs,具有确切分化能力.     

脐血间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的：研究脐血间充质干细胞生物学特性及向神经元样细胞分化的潜能。方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,观察细胞生长情况,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,分别向成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞进行诱导分化,通过茜素红染色、油红O染色检测脐血间充质干细胞成骨、成脂肪细胞诱导分化能力,而以免疫组织化学检测诱导后细胞表面神经标志物的表达。结果：纯化的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈均一梭形,生长曲线呈S型,并以P3代增殖能力最强,细胞表面不表达或弱表达CD34、CD35、CD106,高表达CD29、CD44、CD105。成骨诱导2周后,可检测到钙化基质的形成,成脂肪诱导3周后,可检测到脂滴的形成。向神经元样细胞诱导分化后,可观察到典型的神经元样形态改变,且NSE、NF、GFAP阳性表达。结论：分离纯化的脐血间充质干细胞具有较强的增殖能力与分化潜能,并在体外诱导条件下可以向神经元样细胞定向分化。     

脐血间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的:研究脐血间充质干细胞生物学特性及向神经元样细胞分化的潜能。方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,观察细胞生长情况,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,分别向成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞进行诱导分化,通过茜素红染色、油红O染色检测脐血间充质干细胞成骨、成脂肪细胞诱导分化能力,而以免疫组织化学检测诱导后细胞表面神经标志物的表达。结果:纯化的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈均一梭形,生长曲线呈S型,并以P3代增殖能力最强,细胞表面不表达或弱表达CD34、CD35、CD106,高表达CD29、CD44、CD105。成骨诱导2周后,可检测到钙化基质的形成,成脂肪诱导3周后,可检测到脂滴的形成。向神经元样细胞诱导分化后,可观察到典型的神经元样形态改变,且NSE、NF、GFAP阳性表达。结论:分离纯化的脐血间充质干细胞具有较强的增殖能力与分化潜能,并在体外诱导条件下可以向神经元样细胞定向分化。     

尿源性干细胞移植修复慢性肝损伤裸鼠肝脏功能

该研究探讨尿源性干细胞(urine-derived stem cells, USCs)的生物学性状及移植治疗慢性肝损失模型的可能。分离培养USCs,观察细胞形态、流式细胞术检测干细胞表面标记,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色、茜素红染色、油红O染色、ICG(indocyanine green)摄取实验、PAS(periodic acid-Schiff)染色等评估其成骨、成脂和成肝分化。建立四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)诱导的慢性肝损伤模型,尾静脉4次移植USCs,计算肝脏指数,检测血清ALT、AST, HE及Masson染色,评估治疗效果。结果表明, USCs为米粒状贴壁生长细胞,表达多种间充质干细胞标志物:CD24、CD29、CD73、CD90和CD105,表达细胞周期表面标志物CD146,不表达造血细胞表面标志物CD31、CD34、CD45。成骨成肝诱导的USCs后ALP染色、茜素红染色、油红O染色阳性,单纯成肝诱导后几乎无ICG摄取及PAS染色阳性的细胞,而与肝干细胞共培养的USCs诱导组中,约10%细胞有ICG摄取及PAS染色阳性。与模型组相比, USCs移植组肝脏指数显著降低, ALT、AST降低但无统计学意义,肝细胞退行性变及纤维增生明显改善。该研究成功分离培养出增殖能力强并具有多向分化潜能的USCs,移植入慢性肝损伤裸鼠,可在一定程度上修复肝脏损伤。     

脐带间充质干细胞成脂分化的研究

目的:探讨脐带间充质干细胞向成脂细胞方向分化的潜能,为脂肪组织工程提供一种来源丰富的干细胞来源。方法:采用胰酶和胶原酶Ⅰ型联合消化法获得脐带间充质干细胞,通过免疫细胞化学法对其表面标志物进行鉴定,化学诱导方法诱导脐带间充质干细胞向成脂细胞方向分化,倒置显微镜观察其形态变化,油红O染色对诱导后的细胞进行染色。结果:胰酶和胶原酶Ⅰ联合消化法分离的细胞贴壁生长,呈现成纤维细胞形态,免疫细胞化学显示脐带间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105,但不表达CD31、CD34和CD105,脐带间充质干细胞在成脂诱导培养基中细胞生长速度明显减慢,细胞形态转变为肥大、扁平、含有大量脂滴的脂肪细胞,油红O染色示胞浆充满了油滴空泡。结论:脐带间充质干细胞具有向成脂细胞方向分化的潜能,为脂肪组织工程提供了一种来源丰富、免疫力低和低分化的种子细胞。     

胰岛素样生长因子-1 对脂肪间充质干细胞增殖的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs) 增殖的影响。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁法分离脂肪间充质干细胞,接种于含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM 培 养基中行贴壁培养。流式细胞仪检测ADSCs表面标志物(CD90、CD29、CD31、CD34、CD45)的表达情况,利用成骨、成脂诱导液诱 导ADSCs 向成骨细胞、成脂细胞分化,用碱性磷酸酶、油红O 染色观察。采用终浓度为0、5、10、15、20、30 ng/mL IGF的培养基培 养ADSCs,利用Edu 染色标记ADSCs,分析不同浓度的IGF-1 对ADSCs增殖的影响。结果：流式细胞术显示ADSCs的表型分子 CD90、CD29 呈阳性,CD31、CD45 呈阴性,成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,成脂诱导后油红O染色可见大量脂滴,表明培养的 ADSCs具有成骨、成脂分化的能力。IGF-1 促进ADSCs 增殖的作用随IGF-1 的作用浓度的增加而增加,并逐渐趋于饱和,在趋于 15 滋g/mL的浓度时达到最大促增殖作用,且随着IGF-1 作用时间的延长其促ADSCs 增殖的作用逐渐增强。结论：本实验成功分 离培养ADSCs,IGF-1 对体外培养的ADSCs 有促进增殖的作用。     

小鼠间充质干细胞诱导分化成脂肪细胞miRNA表达的变化

目的：探讨小鼠间充质干细胞（MSCs）定向诱导分化成脂肪细胞微小RNA（miRNA）表达的变化,为进一步研究miRNA调控MSCs向脂肪细胞分化的分子机制奠定基础。方法：采用全骨髓体外分离结合差速贴壁法纯化扩增C57BL／6小鼠MSCs,形态学观察细胞生长情况,并用免疫组化方法鉴定细胞表面抗原CD29、CIM4和CD34的表达。脂肪细胞分化诱导剂诱导MSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色,判断MSCs成脂分化情况。运用rrfiRNA芯片技术检测MSC8和脂肪细胞中差异表达的miRNA。结果：①倒置显微镜下观察,传5代后可获得均一性较高的MSCs;免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性。MSCs经脂肪诱导剂诱导后,胞内大量脂滴形成,油红O染色阳性;②基因微阵列分析表明,小鼠MSCs分化成脂肪细胞差异表达的miRNA共75个,其中20个表达上调、55个表达下调。结论：MSCs分化成脂肪细胞存在miRNA表达的变化,某些miRNA很可能具有重要的调控MSCs成脂分化的作用。     

胰岛素样生长因子-1对脂肪间充质干细胞增殖的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）对脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖的影响。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁法分离脂肪间充质干细胞,接种于含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养基中行贴壁培养。流式细胞仪检测ADSCs表面标志物（CD90、CD29、CD31、CD34、CD45）的表达情况,利用成骨、成脂诱导液诱导ADSCs向成骨细胞、成脂细胞分化,用碱性磷酸酶、油红O染色观察。采用终浓度为0、5、10、15、20、30 ng/mL IGF的培养基培养ADSCs,利用Edu染色标记ADSCs,分析不同浓度的IGF-1对ADSCs增殖的影响。结果：流式细胞术显示ADSCs的表型分子CD90、CD29呈阳性,CD31、CD45呈阴性,成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,成脂诱导后油红O染色可见大量脂滴,表明培养的ADSCs具有成骨、成脂分化的能力。IGF-1促进ADSCs增殖的作用随IGF-1的作用浓度的增加而增加,并逐渐趋于饱和,在趋于15μg/mL的浓度时达到最大促增殖作用,且随着IGF-1作用时间的延长其促ADSCs增殖的作用逐渐增强。结论：本实验成功分离培养ADSCs,IGF-1对体外培养的ADSCs有促进增殖的作用。     

小鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和Survivin的表达研究

为培养及鉴定小鼠来源骨髓间充质干细胞,并测定细胞中Survivin的表达情况,采用全骨髓培养法获取骨髓间充质干细胞,绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,行成骨、成脂检测,RT-PCR测定Survivin表达情况.结果表明培养出的细胞呈长梭状成纤维细胞样,经流式细胞仪检测细胞表面高表达CD29、CD34、CD44、SCA-1,低表达CD117;细胞曲线显示传代细胞培养1～3d生长缓慢,第4d生长加快并于第7d达到高峰;成骨诱导20d经茜素红染色呈红色结节,成脂诱导14d油红O染色显示有大量脂质沉淀;RT-PCR结果显示Survivin mRNA阳性表达.经全骨髓培养法可以培养出大量骨髓间充质干细胞,同时Survivin在小鼠骨髓间充质干细胞中正常表达,提示可能参与骨髓间充质干细胞抗凋亡过程.     

儿童原发性肾病综合征患者尿源干细胞分离培养技术研究

该研究探讨建立儿童原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)尿源干细胞(urine-derived stem cells from pediatric patients with PNS,p-USCs)分离培养技术。体外分离培养细胞,进一步观察细胞形态、分析细胞生长曲线及细胞周期、检测细胞表面标志物表达。采用茜素红及油红O染色检测细胞成骨和成脂分化潜能。结果显示,通过离心、贴壁方法从PNS患儿尿液中分离出的细胞,外观米粒样并呈对数生长;细胞表达间充质干细胞表面标志物CD24(cluster of differentiation 24)、CD29、CD73、CD90,但少数细胞表达CD105,周细胞标志物CD146表达阳性,造血干细胞标志物CD34表达阴性;细胞经成骨成脂诱导后,茜素红和油红O染色均呈阳性。以上结果表明,该研究成功建立了PNS患儿p-USCs分离培养的方法,为探讨p-USCs用于儿童PNS早期肾损伤的诊断及难治性肾病的治疗研究提供前期技术方法。