槲皮素下调hTERT表达对肝癌HepG2细胞生长影响研究

目的观察槲皮素对肝癌HepG2细胞生长及对hTERT基因表达的影响。方法以台盼蓝拒染法计数肝癌细胞的生长抑制率,透射电镜从形态变化上了解凋亡的发生,流式细胞术检测细胞周期变化,western-blot、RT-PCR检测hTERT基因表达改变,PCR-TRAP法检测端粒酶活性。结果台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用明显,且呈浓度和时间依赖性,槲皮素处理48h后的Ic50为25.5μm。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化,流式细胞仪检测表明经10～20μm/L的槲皮素处理,肝癌HepG2细胞周期阻滞于G0/G1期,且HepG2细胞hTERT蛋白和mRNA表达降低,端粒酶活性受抑制。结论槲皮素能抑制肝癌细胞的生长,呈时间、剂量依赖性,能诱导HepG2细胞发生凋亡,其抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调hTERT基因表达,抑制端粒酶活性,破坏端粒稳定性有关。     

下调窖蛋白-1表达抑制小鼠肝癌H22细胞侵袭能力

窖蛋白-1在不同肿瘤中发挥作用不同. 本研究以小鼠肝癌细胞H22为研究对象 ,观察下调窖蛋白-1表达对H22细胞侵袭能力的影响,并探讨其可能的分子机制. 利用RT－PCR和Western印迹法检测了窖蛋白-1在H22及小鼠正常肝细胞IAR20中的 表达.结果显示,窖蛋白 1在H22中的表达高于其在IAR20中的表达,提示窖蛋白 -1高表达可能与H22细胞恶性表型有关. RNA干扰和凝集素印记实验结果显示,窖 蛋白-1－siRNA能够有效抑制窖蛋白－1mRNA和蛋白表达,并抑制细胞表面N－聚糖 β1,6GlcNAc分支形成. Transwell细胞迁移和侵袭实验结果显示,与未转染组和 siRNA 对照组比较,转染窖蛋白-1 siRNA的H22细胞迁移和侵袭数目明显减少. 本研究证明,下调窖蛋白－1表达可抑制H22细胞表面N 聚糖β1,6GlcNAc分支形 成,从而抑制细胞迁移和侵袭能力.     

磷酸化TrkA受体在与其核转位相关的运输膜泡内的定位

大量的跨膜受体能靶向并定位于细胞核内, 但细胞表面的受体是如何转运到细胞核内尚不清楚. 报道了磷酸化的TrkA在人脑胶质瘤细胞株U251中的定位. 利用免疫细胞化学和免疫荧光技术, 发现磷酸化的TrkA主要定位于一系列的运输泡和细胞核内, 这些膜泡包括: 细胞膜侧的环状泡、核周的大核心泡和小核心泡; 同时还观察到大核心泡出芽成小核心泡, 以及小核心泡与核膜相互作用. 基于上述结果认为这些膜泡可能与跨膜受体TrkA转位到核的通路相关.     

CXCL1 在原发性肝癌中的表达及对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的:探究CXCL1在原发性肝癌中的表达及对人肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法:应用免疫组织化学技术(SP二步法)检测48例原发性肝癌组织、13正常肝脏组织中CXCL1表达情况;通过CCK8试剂盒检测CXCL1对HepG2细胞增殖能力的影响。结果:CXCL1在77.1%的原发性肝癌组织中表达,同时CXCL1在原发性肝癌组织中的表达高于正常肝脏组织,差异有统计学意义(P0.01);不同浓度CXCL1处理人肝癌HepG2细胞后,人肝癌HepG2细胞增殖能力明显增强,并且在一定范围内存在明显的剂量效应。结论:CXCL1在原发性肝癌中表达上调;CXCL1能够促进人肝癌HepG2细胞增殖。     

USP9X低表达通过下调Mcl-1促进肝癌细胞凋亡

研究抑制泛素特异性蛋白酶9X（ubiquitin-specific protease 9X,USP9X）对人肝癌（primary hepatocellular carcinoma,HCC）细胞SMMC7721和HepG2中髓细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1,Mcl-1）蛋白的表达调控及对细胞凋亡和生长活力的影响。实验分为USP9X-siRNA组和阴性对照NC组两组进行分析。通过Western blot技术分别检测USP9X在肝癌细胞SMMC7721、HepG2和正常人肝细胞株L02中的蛋白表达情况;应用化学合成USP9X-siRNA转染肝癌细胞SMMC7721和HepG2,通过Western blot、流式细胞仪和MTT检测转染前后Mcl-1的蛋白表达差异以及细胞凋亡和生长活力变化。结果表明,USP9X在肝癌细胞SMMC7721和HepG2中的蛋白表达水平均高于正常肝细胞L02（t=15.155,P=0.000;t=9.171,P=0.001）;SMMC7721和HepG2细胞中抑制USP9X能明显下调Mcl-1的蛋白表达,并导致细胞凋亡增加和生长活力降低。提示,肝癌细胞SMMC7721和HepG2中USP9X表达上调;USP9X表达降低可能通过下调Mcl-1的蛋白表达进而诱导人肝癌细胞SMMC7721和HepG2的凋亡。     

PTPN9的表达下调通过抑制STAT3活化促进结直肠癌细胞凋亡

目的:探讨PTPN9对结直肠癌细胞生长和存活的影响及其机制。方法:建立稳定PTPN9高表达的细胞系,使用Real-timePCR检测其内源性变达,使用细胞集落实验及Caspase-3、Caspase-9,检测其细胞活力及凋亡情况。同时我们抑制了细胞中PTPN9的表达,使用实时PCR来验证敲低效率,应用100μM H_2O_2诱导凋亡模型,利用CCK-8测定来确定细胞活力,Caspase-9和Cas-pase-3测定检测其凋亡情况。最后我们应用Western blot技术,检测PTPN9抑制STAT3通路,来调控细胞凋亡。结果:PTPN9的表达在结直肠癌组织中下调。PTPN9的高表达减慢细胞生长和集落的形成,从而诱导结直肠癌细胞凋亡。相反,PTPN9低表达促进细胞生长和存活。此外,PTPN9负责调控STAT3的活化,并在结直肠癌中抑制核易位,并且通过抑制STAT3通路,来抑制PTPN9低表达对细胞凋亡的影响。结论:PTPN9在结直肠癌组织中通过抑制STAT3的活化而抑制细胞生长和存活。     

在肝癌细胞SK-Hep1中沉默STAT3基因增强sorafenib疗效的初步研究

目的:研究STAT3在肝癌细胞SK-Hep1对sorafenib抗性中的作用,并探讨STAT3基因沉默在增强sorafenib肝癌疗效中的作用。方法:应用基于shRNA的基因沉默技术在肝癌细胞SKHep1中敲减STAT3;用CCK8法检测细胞的生长情况与对sorafenib的敏感性;蛋白印迹法(Western blot)检测STAT3、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)以及其下游蛋白的表达变化。结果:成功构建了STAT3敲减的细胞株SK-Hep1-sh STAT3。该细胞中STAT3蛋白表达降低,细胞增殖明显受到抑制。Sorafenib的处理下调了STAT3的磷酸化水平及其下游蛋白Mcl-1和Cyclin D1的表达。STAT3基因敲减的SK-Hep1细胞,对sorafenib的敏感性增强。结论:基于shRNA的STAT3基因沉默能明显抑制SK-Hep1细胞增殖,提高细胞对sorafenib的敏感性,有望成为提高sorafenib抗肝癌疗效的一种新手段。     

全反式维甲酸下调肝癌细胞HepG2内AFP结合蛋白的表达

当成人肝细胞发生癌变,甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)在血清中的含量会急剧增加.AFP可与细胞表面AFP结合蛋白(AFP binding protein,ABP)结合促使细胞增殖分化.全反式维甲酸(al1-trans retinoic acid,ATRA)通过与特异性维甲酸受体(retinoic acid receptor,RAR)结合发挥抑制肿瘤生长的作用.Western印迹检测肝癌细胞HepG2和HLE中ABP的表达.结果显示,ABP在HepG2细胞中高表达,在HLE细胞中无明显表达.这一结果与2种细胞AFP的表达情况一致.激光扫描共聚焦显微镜定位分析显示,ABP存在于HepG2细胞胞膜和胞浆,用80μmol/L ATRA处理HepG2细胞4 h,可导致RAR入核增加.用不同浓度(20～160μmol/L)ATRA处理HepG2细胞后培养36 h.Western印迹结果表明,细胞ABP的表达随着ATRA浓度的增高而越少,ATRA浓度达80μmol/L时,HepG2细胞的ABP表达减少,ATRA浓度为160μmol/L时,ABP几乎无表达;加入80μmol/L ATRA后,随着作用时间延长,HepG2细胞ABP表达逐渐减少,当作用时间为12 h时,ABP表达明显减少.结果表明,ABP的表达对ATRA的反应呈剂量和时间依赖性.免疫共沉淀结果表明,AFP、ABP及RAR这3种蛋白质具有互相结合的作用.这些结果为进一步深入研究AFP在肝癌发生过程中的作用机制提供了依据.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA抑制鼻咽癌CNE2细胞生长及对Skp2表达的影响

目的研究曲古抑菌素A（TSA）体外对鼻咽癌细胞CNE2的抑制作用及S期激酶相关蛋白2（Skp2）基因表达的影响,并探讨其作用机制。方法采用MTT法观察不同浓度TSA对CNE2细胞的生长抑制作用;采用RT-PCR分析TSA作用前后及不同TSA浓度下鼻咽癌细胞中细胞周期调控基因Skp2的表达。结果不同浓度的TSA对CNE2细胞有明显的生长抑制作用,并呈现一定的量效关系;同时,TSA可降低CNE2细胞Skp2的基因表达,且这种表达与剂量有一定关系。结论TSA能明显抑制CNE2细胞的增殖．其作用机制与细胞周期调控基因Skp2异常表达有关。     

DUSP1在药物诱导的肝癌细胞衰老中的表达变化及其作用研究

目的:在肝癌的治疗中,化学疗法是重要的治疗手段,尤其在结合外科手术切除的联合治疗中,化疗被广泛的应用于临床。而体内试验证实,化疗药物诱导的细胞衰老在治疗肿瘤的过程中,普遍存在并发挥重要作用,我们着重探讨在药物诱导的人肝癌细胞衰老中,细胞内重要信号途径的变化,发现并利用对细胞衰老有重要意义的蛋白,增强化学治疗肿瘤的效果。在本课题中,我们利用化疗药物阿霉素(doxorubicin)和蛋白酶体抑制剂MG132诱导的人衰老肝癌细胞模型,对MAPK信号途径的负调控因子DUSP家族的表达变化进行检测,筛选表达水平发生显著变化的双特异性磷酸酶(DUSP)家族成员,并初步探讨其在细胞衰老中的作用。方法:利用低剂量的阿霉素和蛋白酶体抑制剂MG132诱导人肝癌细胞衰老;通过Real time RT-PCR和Western blotting检测DUSP家族基因mRNA和蛋白质水平的变化;利用siRNA干扰技术敲降DUSP1,检测药物诱导肝癌细胞衰老水平的变化。结果:经低剂量的阿霉素和蛋白酶体抑制剂短时间处理后,人肝癌细胞系Huh7和SMMC-7721细胞发生明显的细胞衰老;在诱导的衰老细胞中,DUSP1mRNA和蛋白质水平呈显著升高。在敲降DUSP1后,MG132诱导的细胞衰老得到显著的缓解。结论:DUSP1在药物诱导的人肝癌细胞衰老中具有重要的作用,为研究临床治疗中化疗药物引起肿瘤细胞衰老的具体机制带来启发。     

Inhibition of STAT3 Signaling Blocks the Anti-apoptotic Activity of IL-6 in Human Liver Cancer Cells

Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine, which may block apoptosis during inflammation to protect cells under very toxic conditions. However, IL-6 also activates STAT3 in many types of human cancer. Recent studies demonstrate that high levels of IL-6 are associated with hepatocellular carcinoma, the most common type of liver cancer. Here we reported that IL-6 promoted survival of human liver cancer cells through activating STAT3 in response to doxorubicin treatment. Endogenous IL-6 levels in SNU-449 cells were higher than in Hep3B cells. Meanwhile, SNU-449 cells were more resistant to doxorubicin than Hep3B cells. Addition of IL-6 induced STAT3 activation in Hep3B cells and led to protection against doxorubicin. In contrast, neutralizing IL-6 with anti-IL-6 antibody decreased survival of SNU-449 cells in response to doxorubicin. To elucidate the mechanism of the anti-apoptotic function of IL-6, we investigated if STAT3 mediated this drug resistance. Targeting STAT3 with STAT3 siRNA reduced the protection of IL-6 against doxorubicin-induced apoptosis, indicating that STAT3 signaling contributed to the anti-apoptotic effect of IL-6. Moreover, we further explored if a STAT3 small molecule inhibitor could abolish this anti-apoptotic effect. LLL12, a STAT3 small molecule inhibitor, blocked IL-6-induced STAT3 phosphorylation, resulting in attenuation of the anti-apoptotic activity of IL-6. Finally, neutralization of endogenous IL-6 with anti-IL-6 antibody or blockade of STAT3 with LLL12 lowered the recovery in SNU-449 cells after doxorubicin treatment. Therefore, our results demonstrated that targeting STAT3 signaling could interrupt the anti-apoptotic function of IL-6 in human liver cancer cells.     

封闭EFNA2 基因表达对肝癌细胞HepG2 的转移和运动的抑制作用

目的:构建Ephrin-A2(EFNA2)基因的干扰RNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞HepG2转移能力的影响。方法:合成EFNA2基因的干扰RNA片段,用基因重组技术构建于腺病毒载体pAD-X,经293细胞包装得到高滴度重组腺病毒pAEFNA2/siRNA,并用real-time PCR进行EFNA2基因表达的验证。将重组腺病毒pAEFNA2/siRNA感染HepG2细胞,48h后用transwell小室法检测病毒对HepG2细胞侵袭和运动能力的影响。结果:经验证病毒正确构建,且HepG2细胞感染病毒pAEFNA2/siRNA后48小时的real-time PCR检测结果未见到有EFNA2基因的表达。病毒感染后transwell小室可见,HepG2细胞的侵袭和运动能力均受到显著的抑制(分别为105±12 v.s.21±7cells/孔和194±22 v.s.39±11,P<0.01)。结论:成功构建了重组EFNA2siRNA腺病毒,并观察到封闭EFNA2对肝癌细胞HepG2的侵袭和运动均有抑制作用。     

Expression of STAT1 and STAT2 in malignant melanoma does not correlate with response to interferon-alpha adjuvant therapy

Interferon-alpha (IFN-) is used as an adjuvant therapy in patients with malignant melanoma and who have undergone surgical resection of high-risk lesions. Defective expression or activation of STAT1 or STAT2 has been shown to correlate with IFN- or resistance in vitro; however, recent data from our laboratory suggest that the anti-tumor effects of IFN- are dependent on STAT1 signaling within host immune cells. We measured STAT1 and STAT2 expression in 28 melanoma biopsies (8 cutaneous lesions; 1 lung metastasis; 19 nodal metastases) obtained from patients prior to the initiation of adjuvant IFN- therapy. Disease recurrence following IFN- treatment did not correlate with the staining intensity of either STAT1 (P=0.61) or STAT2 (P=0.52). Tumors with minimal STAT1 or STAT2 expression (<20% positive) were present in four patients with tumor-positive lymph nodes, who exhibited prolonged relapse-free survival (>44 months) following adjuvant therapy. Conversely, high levels of STAT1 were present in a patient who recurred during the course of IFN- therapy. A case study of one patient who experienced recurrent disease during IFN- treatment revealed that STAT1 levels were greater in the recurrent tumor when compared to the original lesion. These studies provide direct evidence to suggest that levels of STAT1 and STAT2 within the tumor do not influence a patients response to adjuvant IFN-.     

白藜芦醇体外对肝癌HepG2细胞分化及P21^WAF1/CIP1表达的影响

目的：探讨白藜芦醇（Resvratrol,Res）在体外对肝癌细胞分化及相关周期蛋白依赖激酶抑制因子P21^WAF1/CIP1的影响。方法：体外培养肝癌HepG2细胞,用MTT法检白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制作用,用倒置显微镜观察肝癌细胞的形态改变,用放射免疫法检测其AFP分泌,以RT-PCR方法检测HepG2细胞中P21^WAF1/CIP1mRNA的表达,用免疫细胞化学检测其P21^WAF1/CIP1蛋白的表达。结果：白藜芦醇呈时间剂量性抑制HepG2细胞株的增殖,使其亚细胞结构趋于正常,AFP分泌量下降,并显著上调HepG2细胞中P21^WAF1/CIP1mRNA和蛋白的表达。结论：白藜芦醇能诱导HepG2细胞在体外向正常肝细胞分化,并上调其P21^WAF1/CIP1的表达。     

人类抑癌基因beclin 1在胃癌和直结肠癌中表达下调的研究

人类抑癌基因beclin 1通过自噬作用调节细胞生长,但在胃癌和直结肠癌中其表达水平和调控机制仍不清楚．通过检测胃癌和直结肠肿瘤组织中beclin 1基因的表达水平,及DNA异常甲基化和杂合子缺失对其表达的影响,发现与癌旁组织相比,35％的胃癌标本和30％的直结肠癌标本中beclin 1基因表达显著下调．同时发现,beclin 1基因5’端存在一高密度CpG岛,在胃癌和直结肠癌中beclin 1的启动子区域和第二个内含子区域存在甲基化,而杂合子缺失仅在胃癌中发生．这些发现表明beclin 1基因的异常甲基化和杂合子缺失对其在胃癌和直结肠癌中的表达起调控作用．