环指蛋白RING1与A型核纤层蛋白的细胞内相互作用

环指蛋白RING1能结合DNA并抑制基因的转录.采用酵母双杂交方法从人骨骼肌文库中筛选出了与A型核纤层蛋白(lamin A)结合的RING1蛋白,回复杂交酵母能在缺陷培养基上生长.RING1与绿色荧光蛋白融合载体转染HEK293细胞,激光共聚焦显微观察发现RING1能与带红色荧光蛋白的lamin A蛋白在细胞核周围共定位.免疫共沉淀结果证明RING1与lamin A能够相互作用.结果证明了一个新的lamin A结合蛋白,为揭示lamin A影响基因表达乃至细胞衰老提供了依据.     

突变前核纤层蛋白A对细胞衰老的作用

早老症(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)是一种极其罕见的遗传性疾病,它是由LMNA基因突变引起的,产生一个截短的lamin A 蛋白称为 progerin.核纤层蛋白异常A加工积累的 progerin 能够破坏核纤层的支架功能,替代正常蛋白质与其配体结合,导致细胞核畸形和早老表型.     

A型核纤层蛋白的研究进展

A型核纤层蛋白由LMNA基因编码,为核纤层的主要成分,呈动态网状结构,位于核膜下层,起重要的机械支持作用,直接或间接与染色质相互作用,在维持染色质结构、转录、DNA复制和细胞凋亡等方面发挥重要作用.LMNA基因及其编码蛋白lamin A/C异常能引起一组人类遗传病,称为核纤层蛋白病.为深入了解A型核纤层蛋白的正常生理功能及其在相关核纤层蛋白病中的作用,本文就A型核纤层蛋白的结构分类、修饰组装、动力学、相互作用蛋白及相关核纤层蛋白病等方面进行综述.     

凋亡蛋白和Nmi的相互作用及作用位点的筛选鉴定

为研究来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质———凋亡蛋白 (apoptin)诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制 ,利用酵母双杂交系统从人白细胞cDNA文库筛选凋亡蛋白相互作用蛋白质 ,核苷酸序列分析及同源性检索表明 ,其中一个约为 1.2kb的克隆与Nmi(N Mycinteractionprotein)高度同源。细胞免疫共沉淀实验结果显示 ,在哺乳动物细胞水平仍能够检测到凋亡蛋白与全长Nmi的特异相互作用。利用构建好的分别缺失C端 11个氨基酸、中间 33～46位氨基酸和二者均缺失的 3个凋亡蛋白突变体进行相互作用位点研究 ,结果表明凋亡蛋白的 33～ 46位氨基酸(核外运信号 )对于凋亡蛋白与Nmi的相互作用是必需的 ,而C端核定位信号 /DNA结合序列对于凋亡蛋白与Nmi的相互作用不是充分必要的     

A型核纤层蛋白在氧化应激和DNA损伤反应中的作用

核纤层蛋白是一种存在于真核细胞核膜下的中间丝纤维蛋白,是细胞核中重要的骨架蛋白,对维持细胞核的结构和功能具有重要作用。其基因突变会引起一系列的遗传性疾病,称为核纤层蛋白病。这些疾病在细胞水平表现出氧化应激和DNA损伤的特征,提示核纤层蛋白在氧化应激和DNA损伤反应中具有重要作用。本文主要就A型核纤层蛋白在氧化应激、DNA损伤反应中的作用机制进行综述。     

β-淀粉样前体蛋白胞内端与JKTBP2蛋白的相互作用

β-淀粉样前体蛋白APP(β-amyloidprecursorprotein)与阿尔茨海默氏症密切相关,它经分泌酶γ切割后生成的胞内端AID(APPintracellulardomain)能够诱导细胞凋亡。为了研究AID在阿尔茨海默氏症病理过程中的作用,我们以AID为诱饵蛋白用酵母双杂交系统筛选与之有相互作用的蛋白。我们发现人不均一核蛋白D类似蛋白JKTBP2的90-204位肽段可以结合AID。利用293T细胞表达蛋白后进行免疫共沉淀,结果证实二者间存在相互作用。这些结果指出JKTBP2可能在阿尔茨海默氏症形成中有重要作用。     

早老蛋白与淀粉样沉淀前体蛋白相互作用及Aβ的形成

Ａβ在脑内的沉积是Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病的病理现象。对Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病的研究揭示Ａβ的生成与早老蛋白和淀粉样沉淀前体蛋白相互作用密切相关。早老蛋白和淀粉样沉淀前体蛋白基因的突变均能改变淀粉样沉淀前体蛋白的正常切割,使得Ａβ的生成量增加。     

利用双杂交系统对SeNPV泛素与抗细胞凋亡蛋白相互作用的研究

本文报道利用酵母双杂交系统研究甜菜夜蛾核多角体病毒(SeNPV)的泛素(Ubiqutin)与抗细胞凋亡蛋白(IAP2,IAP3)相互作用的结果。使用Clontech公司的MACHMAKER GAL4 Two-hybrid system 3,以病毒ubiquitin基因与酵母GAL4的DNA结合域重组表达“诱饵”蛋白,以病毒iap2或iap3基因与DNA活化域重组表达“猎物”蛋白,在低严谨犁筛选培养基上均得到阳性克隆。这一结果表明,甜菜夜蛾核多角体病毒泛素与IAP2或IAP3在体外能进行相互作用,这种作用利用了酵母内源性E1和E2。SeNPV的抗细胞凋亡蛋白(IAPs)可能是泛素一蛋白酶水解途径(UPP)中的泛素连接酶(E3),或者是泛素依赖性蛋白水解酶的靶底物。     

与TaFRA蛋白相互作用候选蛋白的筛选

F-box蛋白是E3泛素连接酶SCF复合体的重要亚基, 通过底物蛋白的特异识别发挥功能。TaFRA是在盐胁迫差异表达片段基础上通过RACE方法获得的一个基因, 编码F-box蛋白。文章利用TaFRA基因构建诱饵表达载体, 直接用cDNA+pGAD+pBD共转化酵母双杂交的方法筛选相互作用的候选蛋白。通过对阳性克隆的鉴定和测序分析, 共获得44个与TaFRA相互作用的候选蛋白, 其中32个为已知蛋白, 包括硫氧还蛋白、金属硫蛋白、ATP合成酶及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等多种逆境胁迫反应蛋白及转录因子蛋白, 说明TaFRA与胁迫反应相关, 可能通过对上述蛋白编码基因的调控参与了植物的胁迫反应过程, 为进一步阐明TaFRA的功能及作用机制奠定了理论基础。     

猪鼻支原体P37蛋白相互作用蛋白的筛选与鉴定

既往工作表明,胃癌组织中有较高的猪鼻支原体感染率,猪鼻支原体的主要膜蛋白P37能够诱导外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子（TNF）.为了深入研究P37的作用机制,利用酵母双杂交系统筛选与P37蛋白相互作用的蛋白质分子.首先,将编码P37全长的cDNA克隆到pGBKT7载体中,构建“诱饵”表达载体pGBKT7-p37,以此筛选人胎盘组织cDNA表达文库.在2.6×10⁶个克隆中,筛选到一株能与P37相互作用的阳性克隆,序列测定表明,该阳性克隆编码人视网膜色素上皮细胞蛋白（Norpeg蛋白）.在此基础上经GST-Pull Down实验,进一步证实Norpeg蛋白确能与P37相互作用,为进一步研究P37对细胞的作用机制奠定了基础.     

小鼠P311蛋白与类赖氨酰氧化酶-1相互作用的鉴定

P311是利用抑制差减杂交技术从小鼠肺组织中筛选到的一个肺泡发育上游调节基因.它高水平表达于肺泡发育的相关阶段,而在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者肺组织中表达水平大大下降.为深入探讨P311蛋白的作用机制,构建pGBKT7-P311诱饵表达载体,利用酵母双杂交技术,从小鼠肺组织cDNA文库中筛选出P311相互作用蛋白类赖氨酰氧化酶-1(lysyl oxidase-like 1,Loxl-1).并通过体内外免疫共沉淀及双分子荧光互补实验进行验证.为进一步研究P311蛋白的生物学功能提供新的思路。     

用酵母双杂交系统筛选与痢疾杆菌侵袭素IPaC相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选与IpaC相互作用的真核细胞蛋白。首先将IpaC全长基因克隆到诱饵蛋白载体pGBKT7中 ,以构建的pGBKT IpaC为靶蛋白质粒 ,筛选人HeLa细胞cDNA文库。在 2× 10 6个克隆中得到 2 2个阳性克隆。其中 2个阳性克隆编码人胶原酶蛋白片段。并且进一步证明与胶原酶片段相互作用的IpaC结构域在 6 2aa～ 170aa之间。提示IpaC可能在胶原酶参与的生物学过程中发挥作用。     

转录因子X-box结合蛋白1相互作用蛋白的筛选和鉴定

X-box 结合蛋白 1 是一种重要的转录因子,参与体内多项信号转导过程. 为进一步研究 XBP1 的生物学功能,运用酵母双杂交技术在肝细胞文库中筛选 XBP1 的结合蛋白. 首先运用 PCR 技术扩增获得 XBP1 的编码序列,克隆至 pGEM-T 载体,经测序鉴定后,亚克隆至诱饵载体 pGBKT7 中,转化酵母 AH109(a type). 免疫印迹检测诱饵质粒 pGBKT7-XBP1 在AH109 酵母中的表达之后,含有诱饵质粒的酵母 AH109 与含有肝细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母 Y187(αtype)配合,配合后的二倍体酵母生长在含有 X-α-gal 的营养缺陷型培养基上 (SD/-Trp-Leu-His-Ade) 进行选择和筛选,经测序和序列比对确定阳性克隆的开放读码框 ORF,得到 7 种不同的蛋白质. 为了进一步验证这些筛选蛋白质与 XBP1 的相互作用,克隆其中一种蛋白质 MT1E,并运用 GST pulldown 和免疫共沉淀技术成功检测了 MT1E 和 XBP1 的相互作用(体外 / 体内),结果提示,MT1E 可能是 XBP1 的一个新的调节蛋白. 通过酵母双杂交技术筛选得到的 7 种蛋白质分别与肝细胞基础代谢、蛋白质的合成与运输、细胞的增殖与凋亡密切相关. 上述结果有助于揭示 XBP1 的生物学功能,为进一步探讨 XBP1 的表达和调控机制提供新线索.     

GGN3与GGNBP2的相互作用及作用区域确定

生殖细胞缺陷症(gcd)小鼠突变体是上世纪90年代初发现的一种不育突变小鼠,FancL(也叫Pog)的缺失是产生god突变小鼠的原因。FANCL是一种含有PHD结构域的泛素E3连接酶,是Fanconi贫血复合物中的组分之一。在生殖细胞中,FANCL与GGN1和GGN3相互作用,而GGN1和GGN3蛋白的功能还不清楚。为了研究GGN3的功能,揭示更多的参与该过程的蛋白质,运用Clontech公司新开发的第三套酵母双杂交系统以GGN3为诱饵从成年小鼠睾丸cDNA库中筛选与其相互作用的蛋白分子。发现了一个精子生成期间在睾丸中特异性高表达的基因Ggnbp2,免疫共沉淀分析表明,Ggnbp2编码的蛋白质产物GGNBP2在哺乳动物细胞中与GGN3特异相互作用。通过构建突变体,确定了GGNBP2蛋白与GGN3相互作用的区域。以上结果为揭示GGN3和GGNBP2在生殖发育中的功能、丰富生殖细胞发育的蛋白调控网络及其调控规律奠定了一定的基础。     

Retracted: Prelamin A overexpression promotes detrusor calcification/aging in urinary incontinence via prelamin A accumulation

Urinary incontinence (UI) is known as a distressing condition particularly among older adults, and negatively associated with health-related quality of life in both males and females. Prelamin A accumulation has been found in all progeroid laminopathies and is obviously linked to cell and organism aging. Therefore, this study was expected to investigate the effect of prelamin A on detrusor on UI. Prelamin A expression in clinical and animal samples was detected. To investigate the degree of prelamin A accumulation and detrusor calcification/aging, the detrusor cells were subcultured separately into low and high passage. The low-passage subculture cells were treated with transfection of overexpressed prelamin A plasmid, and transfection of overexpressed prelamin A plasmid and application of farnesyl transferase inhibitor (FTIs) H-9279, respectively. Zmpste24, Icmt and lamin A/C expression were detected to explore how prelamin A affected detrusor calcification/aging. Prelamin A was overexpressed in aged detrusor cells, indicating prelamin A expression was positively related to the age of subjects. The degree of prelamin A accumulation and detrusor calcification/aging was higher in aged rats and high passage subculture cells. Zmpste24, Icmt and lamin A/C were poorly expressed in cells transfected with overexpressed prelamin A, as well as cell proliferation activity decreased and calcium deposition and apoptotic rate increased. Furthermore, we also found that the effect of overexpressed prelamin A was lost when cells were treated with H-9279. These findings provide evidence that prelamin A overexpression impairs degradation of its farnesylated form, thus causing prelamin A accumulation which induces detrusor calcification/aging in UI.     

肝细胞生成素在睾丸组织中的相互作用蛋白

肝细胞生成素（HPO）具有复杂的生理功能,在睾丸中的高表达提示其在生殖活动中的重要性,而不仅局限于肝再生.构建了酵母表达载体pGBKT7-HPO,采用酵母双杂交系统,以HPO为诱饵蛋白,从人睾丸cDNA文库中寻找能够与HPO相互作用的蛋白质.经过筛选、验证阳性克隆,并进行PCR、测序和序列比对,得到4种相互作用蛋白质：NADH脱氢酶1、钠/钾ATP酶β3亚基、磷脂酶C δ1以及附睾分泌蛋白.提示HPO可能参与了细胞的蛋白质合成,能量代谢等.通过对候选蛋白的研究,为探讨HPO对睾丸组织细胞功能的调节机制提供了重要的线索.     

酵母双杂交筛选类固醇激素合成急性调节蛋白的相互作用蛋白质

目的:利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与类固醇激素合成急性调节蛋白(STAR)相互作用的蛋白质。方法:将全长STAR基因克隆到酵母表达载体pDBLeu中,形成诱饵;将构建好的诱饵质粒转化至AH109酵母感受态中,利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,并进行相互作用的回转验证。结果:构建了酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-STAR,并筛选到6个猎物,其中有5对相互作用回转验证阳性。结论:为进一步研究STAR的功能和作用机制提供了新的线索。     

酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。