灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

高温胁迫下番茄幼苗对冷激的响应

高温逆境是影响夏秋季蔬菜设施集约化育苗质量的主要因素之一,利用温度逆境诱导植物产生交叉适应是植物获得抗逆性的一种有效手段.为探索冷激强度对番茄幼苗高温胁迫的缓解效应,试验采用人工气候箱模拟夏季设施中的高温胁迫,研究了不同冷激温度(5、10、15 ℃)和冷激持续时间(10、20、30 min)对番茄幼苗生长、生物膜保护系统的影响,并研究了单次适宜冷激处理对番茄小分子热激蛋白LeHSP23.8和CaHSP18基因表达的影响.结果表明： 在高温胁迫前对番茄幼苗进行冷激处理可以抑制其下胚轴的伸长和株高的生长.冷激缓解番茄幼苗高温胁迫的效应在不同冷激温度下表现出不同的变化趋势;5 ℃冷激处理抑制了番茄幼苗抗氧化酶活性的升高,使细胞膜透性增大,对幼苗产生伤害;10 ℃冷激处理对番茄幼苗高温胁迫的缓解效应随冷激时间的延长呈降低趋势;而15 ℃冷激处理缓解番茄幼苗高温胁迫的效应随冷激时间的延长呈增加趋势.适宜冷激温度和冷激持续时间能够诱导番茄幼苗对高温逆境的交叉适应性,在高温胁迫前将番茄幼苗进行温度为10 ℃、持续10 min的冷激处理效果最佳,与对照相比,显著提高了高温胁迫下番茄幼苗植株单株干质量和壮苗指数,降低了番茄幼苗叶片相对电导率和丙二醛含量,促进了脯氨酸和可溶性蛋白的积累,提高了番茄幼苗叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT) 3种抗氧化酶活性,并诱导了小分子热激蛋白基因LeHSP23.8和CaHSP18在常温条件下的上调表达.
     

夜间低温对番茄幼苗磷素吸收及转运的影响

以‘辽园多丽’番茄幼苗为试材,采用营养液栽培模式,以夜温15℃为对照,对夜间低温(6℃)影响番茄幼苗磷素吸收及转运过程的因素进行研究。结果显示:(1)夜间低温胁迫导致番茄幼苗根系活力受到显著抑制。(2)夜间低温条件下,番茄幼苗根系中酸性磷酸酶活性无明显变化,而其地上部酸性磷酸酶活性增强,且以叶片中活性增加较大。(3)夜间低温胁迫使根系中磷酸盐转运蛋白基因LePT1和LePT2的相对表达量较对照增加,地上部磷酸盐转运蛋白基因LePT1的表达受到抑制,且叶片中受到的抑制作用更显著。(4)夜间低温胁迫处理营养液中剩余磷素含量始终多于对照;其番茄幼苗地下部和地上部中磷素绝对含量均下降,且叶片比茎的下降幅度更大。(5)夜间低温胁迫使番茄幼苗伤流强度下降,伤流液中磷素含量随着处理天数的增加而增加,在处理第9天时极显著高于对照。研究表明,夜间低温导致番茄幼苗根系活力降低,诱导植株中磷酸盐转运蛋白基因LePT1的表达下调以及伤流强度降低,从而引起磷素由茎向叶片中的转运过程受到明显抑制。     

樱桃番茄幼苗对硝酸盐胁迫的生长和生理响应

以樱桃番茄(Lycopersicon esculentum Mill.var.cerasiforme Alef.)品种‘大红樱桃番茄’为材料,采用水培试验研究了外源施加0、50、100、150和200mmol·L-1硝酸盐(NO3-)对樱桃番茄幼苗生长和生理生化指标的影响。结果表明:硝酸盐处理6d后,番茄幼苗株高、鲜重、干重和相对含水量随着处理浓度的增加呈下降的趋势,而根冠比呈先增加后下降的趋势;番茄幼苗根系硫代巴比妥酸反应物(TBARS)、活性氧(ROS)、H2O2和蛋白羰基(PC)的含量均随着处理浓度的增加而增加;番茄幼苗根系SOD、POD、CAT和APX活性和基因表达均随着处理浓度的增加而降低,而其根系脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量随着处理浓度的增加而增加。研究发现,樱桃番茄幼苗生长在硝酸盐浓度为50mmol·L-1时受到影响不大,但硝酸盐浓度达到100mmol·L-1时已对番茄生长产生显著胁迫,导致膜脂氧化损伤,降低抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性,但番茄也能够通过调节渗透调节剂的合成代谢来抵御硝酸盐胁迫,从而表现出一定的硝酸盐耐受性。     

盐芥ThMSD基因在大肠杆菌中的表达及特性研究

超氧化物歧化酶(SODs)是真核生物中广泛存在的含金属抗氧化酶,包括Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD 3种.植物线粒体中的Mn-SOD在植物抗逆中发挥重要作用.ThMSD是前期工作中从极度抗逆植物盐芥中克隆到的Mn-SOD编码基因.将ThMSD连接到原核表达载体pET30a(+),转化到BL21,获得重组菌BL21(pET30a-ThMSD).SDS-PAGE分析表明,重组菌在32kDa处有明显的诱导条带,与理论大小一致.Western blotting分析表明,诱导的条带能和抗His标签的单克隆抗体发生特异性反应.对3个重组子的可溶性全蛋白进行SOD活性分析,发现均高于空白对照菌.选择能大量表达ThMSD的重组子进行大量诱导表达,通过镍亲和层析纯化目的蛋白.对纯化的ThMSD重组蛋白进行热稳定性分析,结果表明,55℃下ThMSD仍有50％以上活性,42℃处理40 min后仍保持60％以上活性.在重组菌BL21(pET30a-ThMSD)对NaCl的抗性分析实验中,当培养基中盐浓度高于正常值时,在所测定阶段重组菌的生长速度均高于对照菌.可见,经原核表达的重组蛋白ThMSD具有较强的SOD活性及热稳定性,表达ThMSD基因的BL21菌株提高了对NaCl的耐受力.推测盐芥ThMSD基因与盐芥极强的抗逆性有密切联系.     

番茄LeNHX1基因植物过量表达载体的构建及表达分析

从番茄幼苗中提取RNA,根据NCBI中番茄LeNHX1基因序列设计引物,通过RT-PCR获得了番茄LeNHX1基因的cDNA序列,包含一个1 605 bp的开放阅读框,编码534个氨基酸。将cDNA序列连接到植物过量表达载体PBI121上,对所获得的重组质粒进行双酶切鉴定,结果表明,植物过量表达载体PBI121-LeNHX1已构建成功。半定量RT-PCR结果表明LeNHX1基因在根、茎和叶中均表达,盐、低温和脱落酸的诱导能提高LeNHX1基因的表达量,推测番茄LeNHX1基因在逆境应答中可能起着重要作用。     

铜胁迫下海州香薷根中铜诱导蛋白的鉴定

以铜耐性植物海州香薷为材料,在水培条件下对其幼苗进行不同浓度的CuSO4处理,通过铜结合蛋白分析和双向电泳(2D-AGE)分析,研究铜胁迫条件下海州香薷根中铜诱导蛋白的结合方式及表达情况.结果表明(1)100μmol/L CuSO4处理海州香薷幼苗6 d,可使其根中蛋白巯基的含量显著升高.(2)将其蛋白提取液通过SephadexG-50后,发现洗脱液中铜诱导物的增加与铜分布显著相关,表明铜诱导蛋白可能为铜结合蛋白.(3)通过2D-PAGE和质谱分析发现,铜胁迫下类抗性蛋白、S-腺苷甲硫氨酸合成酶和脂肪酸羟化酶的表达升高,而抗坏血酸过氧化物酶和半胱氨酸合成酶表达则降低.     

过量表达叶绿体小分子热激蛋白提高番茄的抗寒性

小分子热激蛋白与植物耐寒性提高有相关性,但是没有直接的实验证据能证明小分子热激蛋白的存在增加植物抗寒性.我们克隆了番茄叶绿体(定位)小分子热激蛋白cDNA,并将35SCaMV启动子驱动的番茄叶绿体小分子热激蛋白cDNA植物表达构架导入番茄,测定转基因番茄和未转基因番茄的抗寒性水平.低温处理后,转基因番茄的冷害症状轻于未转基因的番茄;转基因番茄细胞电解质外渗较少、花青素和MDA累积量较低;净光合速率和叶绿体含量高于对照.这些实验结果说明叶绿体小分子热激蛋白的过量表达提高了植物抗寒性.     

猪瘟病毒NS2-3抗原集中区基因的原核表达及鉴定

为获得猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV) NS2-3抗原集中区蛋白,并建立CSFV抗体快速检测方法.本研究以CSFV全长基因组质粒为模板,PCR扩增NS2-3抗原表位集中区,利用扩增片段和克隆载体,构建重组表达质粒,命名为pET32a-NS2-3-1.重组表达质粒转化Rosetta (DE3)细胞,利用IPTG诱导表达, SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定重组表达产物.结果表明,重组质粒pET32a-NS2-3-1在28℃诱导5 h得到高效表达,重组蛋白能够与兔抗CSFV阳性血清发生反应.获得CSFV NS2-3抗原集中区蛋白,并且获得的重组蛋白具有抗原性,能够作为CSFV抗体检测的抗原.     

外源Ca2+对水杨酸诱导番茄抗灰霉病的增效机制

探讨了外源Ca²⁺对水杨酸(SA)诱导番茄抗灰霉病的增效机制.以番茄灰霉病敏感型品种‘L402’幼苗为材料,分别进行H₂O(对照)、SA、SA+Ca和SA+EGTA(Ca²⁺螯合剂)处理,期间(1～5 d)分析各处理植株叶片活性氧(ROS)含量,苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,以及病程相关蛋白编码基因PR1、PR2和PR3表达水平的变化,并调查处理3 d后灰霉病情指数.结果表明： 与对照(病情指数为74.8)相比,SA、SA+Ca和SA+EGTA处理的植株叶片灰霉病的病情指数分别为46.9、38.5和70.3;SA处理明显提高叶片ROS含量以及苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,这些参数在SA+Ca处理的植株中被进一步提高,但在SA+EGTA处理的植株中则被降低;SA处理明显提高了PR1、PR2a和PR3b的表达水平,Ca²⁺进一步加强了这一效果,而EGTA则起抑制作用.SA或SA+Ca处理期间的PR2b和PR3a表达较未处理的对照上调了1～2倍,而PR1、PR2a和PR3b上调了2～5倍.表明Ca²⁺对SA诱导番茄抗灰霉病具有增效作用,其机理至少与Ca²⁺和SA协同作用促进ROS形成有关,而ROS作为信号分子增加植株抗病相关酶活性以及PR1、PR2a和PR3b等防卫基因的表达.