一株蓝麻黄内生放线菌的分离、鉴定和活性研究

目的:分离对农作物致病菌具有拮抗作用的株内生放线菌,并对其进行系统鉴定.方法:经表面消毒采用研磨法从蓝麻黄中分离内生放线菌;再通过琼脂扩散法筛选具有抗农作物致病菌活性的内生放线菌;利用菌株形态特征、培养特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析对拮抗菌进行鉴定;并对代谢产物做了生物碱的检测.结果:从蓝麻黄中分离到菌7株内生放线菌而其中的XJEG-GA-16具有较好拮抗作用,该菌对7种植物病原菌具有较好的拮抗作用,尤其是对玉米大斑病菌的拮抗作用显著抑菌圈大于20mm.经形态学观察,培养特征、生理生化特和分子分类学分析鉴定与Streptomyces albus subsp.albus在同一个分支上,同源性为99%.该菌株代谢产物中含有生物碱.结论:蓝麻黄内生放线菌XJEG-GA-16对农作物致病菌有明显的拮抗作用,最终鉴定为链霉菌Streptomyces albus subsp.Albus.     

药用植物内生放线菌的分离、筛选及活性菌株YIM 61470鉴定

从云南西双版纳热带雨林多种药用植物中分离到272株内生放线菌,活性筛选表明 146株菌的发酵产物具有抗菌活性,其中94株菌具有拮抗病原细菌活性,127株菌具有抑制病原真菌的功能.分离菌株YIM 61470具有广谱抗菌活性,通过形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞化学分类特征和基于16S rRNA基因序列的相似性分析等研究,菌株YIM 61470被鉴定为链霉菌属(Streptomyces)氢化链霉菌(S.llydrogenans)的一个菌株.     

喜树种子内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性物质初分离

【目的】探究含有抗肿瘤活性喜树碱的喜树(Camptotheca acuminata Decne.)种子中内生放线菌的多样性,以及从内生放线菌中寻找新型活性化合物产生菌。【方法】利用放线菌富集培养基分离喜树种子内生放线菌,并根据菌落形态及16S rRNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定;以及利用与病原微生物共培养方法检测分离菌株的抗菌活性。【结果】从上海交通大学校园的喜树种子中共分离到33株内生疑似放线菌,经基于16S rRNA基因序列分析的分子鉴定,确定其中21株属于链霉菌,1株属于拟诺卡氏菌,另有3株由于序列相似性低于95%而无法分类;8株因未能克隆16S rRNA基因序列而未确定分类。这11株疑似内生放线菌是否是新放线菌(种)类群,有待后续深入研究。初步的抗细菌、真菌活性检测发现,分离到的内生放线菌中42.42%以上对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)有很强的抑制菌核形成的作用,54.54%内生菌有较强抑制芽孢杆菌生长的作用。并且挑选其中具有代表性的菌株Streptomyces sp.CXSZ1进行代谢产物的分析,初步发现其代谢产物中含有抗细菌活性成分。【结论】喜树种子内生放线菌的分离、鉴定及生物活性物质分离鉴定的研究工作,一方面可以为揭示喜树等高等植物种子内生菌的起源、演化等提供有价值的信息,同时也为新结构、新活性化合物发掘提供实验材料。     

假橐吾内生菌分离及其拮抗菌的筛选与鉴定

从菊科植物假橐吾(Ligulariopsis shichuana Y.L.Chen)中分离得到110株内生真菌和26株内生放线菌,依照形态培养特征对菌株进行初步分类鉴定,采用琼脂块法进行拮抗菌株筛选,并对拮抗性最好的2株内生放线菌进行分子鉴定.结果表明:(1)经初步鉴定,将分离到的假橐吾内生真菌合并为86种,分为10个属,其中交链孢霉属和丝核菌属占优势(分别为41.9%和16.3%);内生放线菌分为3个属,其中链霉菌属占优势(92.3%).(2)抗菌活性试验表明,有31株内生真菌分别对细菌、植物病原真菌具有显著抑制作用,全部内生放线菌对靶标菌有抗性,其中菌株wz57和wz01拮抗性最强.(3)根据16S rDNA序列比对结果,菌株wz57和wz01与链霉菌属(Streptomyces griseoplanus)相似性最高,分别达到99.3%和99.5%,初步归为Streptomyces griseoplanus.     

三七内生放线菌的分离及拮抗三七根腐病原活性研究

挖掘云南文山三七内生放线菌菌种资源以及对分离到的放线菌菌株进行三七根腐病病原菌的抗菌活性评价，为生物防治三七根腐病的发生、传播、有效治理及解决三七连作障碍和后续研究三七内生放线菌的代谢产物提供菌种资源。采用三种分离方法、六种分离培养基对文山两个产地三七全株植物进行内生放线菌分离，分离到的菌株通过16S rRNA基因扩增测序鉴定到属，通过琼脂扩散法对菌株发酵液进行抗菌活性初筛。共分离到56株内生放线菌，经形态特征初步排重后，选22株代表菌株进行16S rRNA基因扩增测序，并鉴定到属，其分属于链霉菌属(Streptomyces)、放线产孢菌属(Actinomycetospora)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、黄英菌属(Yinghuangia)四个属。对23株菌株发酵液进行抗菌活性初筛，14株菌株(60.87%)具有不同程度的抗菌活性，其中菌株S004、S006、S014、S016、S022、S042、S047、S053对三七根腐病病原菌有较好的抗菌活性，具备进一步深入研究的价值。本研究初步探索出适合三七内生放线菌分离的分离方法，获得一批三七内生放线菌菌种资源，并筛选出8株对...     

基于化学遗传学筛选产萘醌类化合物内生放线菌

【目的】为探究含具有抗肿瘤活性的美登素的滑桃(Trewia nudiflora)种子中内生放线菌的多样性,以及从内生放线菌中寻找萘醌类化合物产生菌。【方法】利用放线菌富集筛选培养基对经消毒处理的滑桃种子进行内生菌分离,根据菌落形态及16S rRNA基因序列分析进行菌种的分类鉴定。通过对所分离到的内生放线菌拮抗模式病原细菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)、作物病原真菌(小麦赤霉菌、水稻纹枯病致病菌等)活性检测,以及萘醌类化合物合成关键基因为探针定向筛选萘醌类化合物产生菌。【结果】从分离到的100余株滑桃种子内生菌中鉴定出66株以链霉菌为主的放线菌,发现Streptomyces sp.HTZ27菌株含有目标基因,经固体发酵、化合物分离纯化、鉴定后,发现该菌发酵产物中有呋喃萘醌I,得率接近5 mg/L。【意义】本研究采用的化学遗传学方法可有效提高筛选目标化合物产生菌的效率,所筛选到FNQ I产生菌为深入研究呋喃萘醌类化合物生物合成与调控、抗肿瘤分子机理以及产业化应用等创建了有利条件。     

百部内生放线菌的分离、分类及次级代谢潜力

【目的】以对叶百部块根为材料分离内生放线菌,并对分离菌株进行分类、抗菌活性和次级代谢产物合成基因研究。【方法】样品经过严格的表面消毒,选用4种培养基分离百部内生放线菌;分离菌株通过形态观察和16S rRNA序列分析进行分类鉴定;采用琼脂移块法测试分离菌株的抗菌活性;通过PCR检测分离菌株的PKS/NPRS和卤化酶基因;使用HPLC-UV/VIS-ESI-MS/MS分析发酵产物。【结果】从6个样品中获得18株内生放线菌,分属链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)和甲基杆菌属(Methylobacterium)。分离菌株绝大部分具有抗菌活性和次级代谢产物合成基因,其中13株对耐药金黄色葡萄球菌和/或绿脓杆菌有拮抗活性,17株具有PKS/NRPS基因,8株菌具有卤化酶基因,且卤化酶阳性代表菌株的发酵产物具有抗细菌活性和卤代化合物特征。【结论】百部作为一种传统中药,其内生放线菌以链霉菌和小单孢菌为主,在次级代谢产物合成方面具有很好的潜力,可作为一类重要微生物资源进行活性产物开发。     

丹参植株内生菌的分离纯化及其抗病性研究

为探明丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)内生菌的种类,筛选拮抗农作物病害菌的生防菌株,从健康丹参植株中进行内生菌分离,依照形态特征以及16SrDNA序列对菌株进行初步分类鉴定,采用琼脂块法进行拮抗菌株筛选,并选取拮抗活性较强的菌株液体发酵进行体外抑菌试验。结果表明:(1)从丹参植株中共分离得到69株内生菌(真菌62株、放线菌7株),其中23株内生真菌属于无孢类群或现有条件不适合产孢,其余真菌菌株中串珠镰孢菌属(Fusarium moniliforme Sheld.)和交链孢菌属(Alternaria sp)为优势菌群;7株内生放线菌均为链霉菌属。(2)病原菌拮抗性实验表明,有44株内生菌对病原菌具有不同程度的拮抗活性,其中12株内生菌对2种及以上靶标病原菌具有拮抗活性,表明丹参内生菌具有一定的广谱抗菌性。(3)放线菌菌株A232的次级代谢产物对白色假丝酵母(Canidia albicans)和苹果腐烂菌(Valsa mali)都表现出较强的拮抗活性,通过形态、培养特征以及16SrDNA序列分析,鉴定其为Streptomyces luteoverticillatus。     

剑叶龙血树内生放线菌活性菌株的筛选和鉴定

为筛选具有抗菌抗肿瘤活性的药用植物内生菌资源,该文对300余株分离自中国云南西双版纳及越南地区剑叶龙血树的内生放线菌采用琼脂块扩散法进行抗病原细菌活性筛选、平板对峙法进行抗真菌活性筛选、SRB法测定菌株的细胞毒活性及PCR扩增方法筛选非核糖体肽合成酶NRPS基因及聚酮合酶PKS-I、PKS-Ⅱ基因;对得到的优势菌株经8种培养基进行发酵,采用10种病原细菌、3种病原真菌及2种人肿瘤细胞株测试其发酵粗提物的抗菌及抗肿瘤活性以确定最佳发酵培养基;用16S rRNA基因测序方法初步鉴定5株优势菌株的分类地位。结果表明:初筛得到5株抗菌活性、体外细胞毒活性及NRPS、PKS相关基因表达阳性的菌株S01-S05,其中4株(S01-S04)属于链霉菌属、1株(S05)属于类诺卡氏菌属;菌株经不同培养基发酵后产物的抗菌和抗肿瘤活性不同,其中Streptomyces sp. S04在7种培养基中的发酵提取物对8种测试病原菌均有较强抑制作用,且该菌株用Medium C的发酵提取物对人肝癌Hep G2细胞株抑制率达到100%,为剑叶龙血树内生菌活性成分挖掘及新型抗菌药物筛选奠定了基础。     

一株白芍内生放线菌的分离、活性及系统发育分析

目的:分离白芍中拮抗农作物致病菌和人类常见病原菌的内生放线菌,并进行系统发育分析。方法:采用3种分离培养基,从白芍根部分离内生放线菌;通过滤纸片法筛选具有拮抗活性的菌株,观察菌丝形态,并进行16S rDNA序列系统发育分析。结果:从白芍中分离得到16株内生放线菌,其中从FYSCA培养基中分离到9株;16株内生放线菌中有6株具有拮抗作用,菌株S-BS033004对5种病原菌有拮抗活性,尤其是对棉花黄萎病菌和小孢拟盘多毛孢菌和耐青霉素类金黄色葡萄球菌的拮抗作用显著,抑菌圈≥20mm。经16S rDNA系统发育分析表明该菌株与Streptomyces anulatus NBRC13369T等6株链霉菌模式菌株亲缘关系较近,相似性均为99.7%。结论:白芍内生放线菌S-BS033004是一株杀菌谱较广的链霉菌,具有很好的开发潜力。     

银杏内生菌的分离及其抑菌活性筛选

从健康的银杏（Ginkgo biloba）茎和叶片中分离内生菌,结果从银杏叶和茎上共分离到内生真菌20株,其中9株来自银杏茎部,11株来自银杏叶部;内生放线菌23株,其中15株来自于银杏茎部,8株来自于银杏叶部;内生细菌15株,其中8株来自于银杏茎部,7株来自于银杏叶部。以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为指示菌,采用双层平板法对内生菌进行抑菌活性筛选,结果表明：20株内生真菌中有12株出现了抑菌活性,有抑菌活性菌株的比例为60.0%;23株内生放线菌中,仅3株出现了抑菌活性,有抑菌活性菌株的比例为13.0%;15株内生细菌中,有4株出现了抑菌活性,有抑菌活性菌株的比例为26.7%。     

海南粗榧内生真菌抗肿瘤抗菌活性的筛选

对72株海南粗榧(Cephalotaxus hainanensis Li)内生真菌进行了抗肿瘤和抗菌活性筛选。结果显示, 有9株内生真菌至少对一种指示瘤株具有细胞毒活性, 5株内生真菌对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性, 1株内生真菌对辣椒疫霉有抑制作用。这表明海南粗榧内生真菌是寻找有价值的生物活性成分的潜在资源, 其生物活性成分值得进一步研究。     

药用植物青蒿不同种类的内生菌抑菌活性分析

为了研究青蒿不同种类的内生菌抑制细菌和抑制真菌的活性,该研究采用组织块法和研磨法从青蒿的根、茎、叶中分离内生细菌、放线菌和真菌,以大肠埃希菌(Escherichia coli)(CICC 23657)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(CICC 10275)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CICC 10384)、黑曲霉(Aspergillus niger)(CICC 2487)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(CICC 33032)为指示菌,采用琼脂块法和双层平板法检测内生菌的抑菌活性。结果表明:(1)从青蒿植株中共分离到76株内生菌,其中内生细菌19株、内生放线菌34株、内生真菌23株。从分离部位来看,56株来自于茎段、17株来自于根段、3株来自叶片。(2)内生细菌中抑菌活性菌株占总菌株的比例最高,为95%,内生放线菌和内生真菌中抑菌活性菌株的比例分别为41%、35%。(3)内生细菌的抗菌谱较广;虽然内生放线菌的抗菌谱较窄,但其中高抗菌株较多,尤其对酿酒酵母的抑菌效果好。综上结果显示,药用植物青蒿中存在着丰富的有抑菌活性的内生菌,且不同种类的内生菌抑菌活性不同。     

抗肿瘤海绵放线菌的分离及菌株HA01184的鉴定

目的：对采自海南、湛江等海域的海绵样品进行放线菌选择性分离,采用其发酵液进行抗肿瘤活性筛选,并对活性较好的菌株进行鉴定。方法：用含50μg／mL重铬酸钾为抑制剂的海水高氏一号合成培养基分离培养海绵放线菌;以MTT法进行菌株的抗肿瘤活性筛选;通过培养特征、形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列测定及系统发育分析,对菌株HA01184进行鉴定。结果与结论：海水高氏一号合成培养基用于海绵放线菌分离培养具有很好的选择性,从海绵样品中共分离得到放线菌165株,细胞毒活性达80％以上的阳性菌株有10株,其中菌株HA01184的发酵液细胞毒活性为90％。结合形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列比对分析,将HA01184归于链霉菌属,可能是来自海洋环境的一个潜在新种。     

灯台树内生放线菌多样性及抗菌活性评价

从云南西双版纳采集7份灯台树样品,经过表面消毒,用4种分离培养基分离得到105株内生放线菌。经16S rRNA基因序列分析鉴定,分布于7个科9个属。利用5种植物病原真菌指示菌对所有菌株的发酵液进行抗菌活性检测。结果显示,有12.4%、14.3%、11.4%、12.4%、8.6%的菌株分别对镰刀霉、疫霉、赤星霉、苹果炭疽、白色念珠菌有抗性。对3株具有广谱抗菌活性的菌株进行再次发酵和抗菌活性复筛,结果显示这3株的抗菌活性稳定,并可能含有生物碱类化合物。     

药用昆虫喙尾琵琶甲肠道抗菌活性放线菌的筛选及鉴定

【目的】探究药用昆虫喙尾琵琶甲Blaps rynchopetera肠道具有抗菌活性的放线菌,为抗菌药物开发提供新的放线菌资源。【方法】结合稀释涂布法和选择培养法从喙尾琵琶甲成虫肠道分离放线菌。以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methieillin-resistant Staphylococus aureus)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌Escherichia coli、粪肠球菌Enterococcus faecalis、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium 和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 6株致病细菌以及黑曲霉Aspergillus niger、青霉菌Penicillium expansum和白色念珠菌Canidia albicans 3株致病真菌为指示菌,通过牛津杯琼脂扩散法测试放线菌次生代谢产物的抗菌活性。随后,采用分子生物学方法进行16S rRNA序列分析鉴定活性显著的18株放线菌并构建系统发育树。【结果】从喙尾琵琶甲成虫肠道中分离到176株共生放线菌,初步活性筛选结果显示其中46株放线菌表现出不同程度的抗菌活性。多株放线菌对致病菌具有广谱的抑菌作用且抑菌圈直径超过阳性对照药。选择抑菌圈直径大于15 mm的18株放线菌进行分子鉴定,结果显示均为链霉属Streptomyces。【结论】喙尾琵琶甲肠道含有丰富的抗菌活性放线菌资源。     

东乡野生稻内生放线菌分离及菌株S123次级代谢产物分析

【目的】从东乡野生稻(Oryza rufipogon)中分离和鉴定内生放线菌,对其进行抗菌活性筛选,并分析高抗菌活性菌株S123的次级代谢产物。【方法】采用S培养基对东乡野生稻内生放线菌进行分离、纯化,并构建16S rRNA基因序列系统发育进化树进行菌株鉴定。以琼脂扩散法和菌丝生长速率法进行抗菌活性筛选,同时设计简并引物检测菌株I型聚酮合酶(PKS-I)基因。对具广谱抗菌活性的菌株S123进行分批大量发酵,运用多种色谱方法对发酵产物进行分离、纯化,利用MS和NMR分析鉴定化合物的结构。【结果】从东乡野生稻中共分离到11株内生放线菌,分别属于链霉菌属(8株)和假诺卡氏属(3株)。其中有8株具有抗菌活性,8株呈现I型PKS阳性。从高抑菌活性菌株S123中分离到化合物Nigericin和17-O-demethylgeldanamycin,其中Nigericin对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及水稻纹枯病菌均有抑制活性。【结论】对东乡野生稻内生放线菌进行了分离、鉴定和抗菌活性筛选,并从中分到两种与I型PKS基因相关活性的化合物Nigericin和17-O-demethylgeldanamycin,为研究东乡野生稻内生放线菌的多样性和次级代谢产物的分离提供依据。     

黔西南薏苡内生真菌多样性及其抗菌活性研究

为进一步了解贵州黔西南薏苡(Coix lacryma-Jobi)可培养内生真菌的多样性组成及其抗菌活性。通过组织块分离法,选取薏苡根、叶和种仁为分离对象,进行内生真菌分离,并通过形态学观察,分子生物学特征对所分离内生真菌进行鉴定。采用平板菌块对峙法对薏苡内生真菌进行抗菌活性筛选。从薏苡根、叶和种仁中共分离纯化获得76株薏苡内生真菌,根据形态和分子生物学特征,它们属于10个目、14个科、26个属和1个不明属以及未知菌;以大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为指示菌株,对薏苡内生真菌进行抗菌活性筛选。其中有25株对大肠杆菌具有抗菌活性,占分离菌株的比例为32. 9%;有34株对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,其比例为44. 7%;有24株对枯草芽胞杆菌具有抗菌活性,比例是31. 6%;有23株对酿酒酵母具有抗菌活性,占比例为30. 3%;对4种标准菌株都有抗菌活性的有13株,占总株数的17. 1%。薏苡的不同组织结构中存在丰富的内生真菌资源,部分内生真菌具有抑制其他微生物生长的活性,具有产生天然活性产物成分的潜力,为工业应用奠定了资源基础,具有进一步发掘和研究的价值。     

春兰内生真菌的分离及其抑菌活性的初步研究

采用平板分离法从皖西大别山野生兰花的根、茎、叶中分离内生真菌32株,用琼脂块法对获取的菌株进行抑菌活性筛选,其中有4种兰花内生真菌对供试菌株有抑菌作用,占总分离菌株的12.50%,对抑菌活性较强的一株内生真菌进行形态学鉴定,结果表明它属于无孢类群。