利用Tol2转座子构建转基因草金鱼初探

青鳉Tol2转座子是脊椎动物中发现的第一例天然具有活性的转座子,目前已经被成功应用于多种模式动物的转基因研究中。采用PCR的方法以质粒pCAgcGH为模板亚克隆出一段含有草鱼生长激素(GH)5个外显子、鲤鱼β-actin启动子及多个酶切位点的序列,并将这段序列与经双酶切处理的质粒pTol2-MCS-EGFP进行重组连接,得到重组质粒pTol2-GH-EGFP。采用显微注射的方法将重组质粒pTol2-GH-EGFP与体外合成的Tol2转座酶mRNA一起注入草金鱼受精卵中。通过观察绿色荧光和PCR检验绿色荧光蛋白和GH基因的表达,筛选出成功转入外源基因的草金鱼。阳性表达检出率为17.3%。利用Tol2转座子构建转基因草金鱼,不仅丰富了Tol2转座子的应用范围,而且为进一步利用Tol2转座元件进行观赏鱼转基因及基因表达研究奠定了基础。     

青鳉Tol2转座子研究进展

鳉鱼Tol2转座子作为hAT（hobo/Activayor/Tam3）转座子家族中的一员,是目前所发现的唯一的天然存在且有转座活性的脊椎动物转座子。本文从Tol2转座子的结构,转座机制和应用方面作一个综述。     

利用Tol2转座子构建斑马鱼心脏组织特异表达转基因载体及其表达分析

为了制备用于在斑马鱼心脏中特异表达目的基因的转基因载体,通过分子克隆的方法对能够在斑马鱼心脏中特异表达EGFP报告基因的Tol2载体进行了改造,在原有的CMLC2启动子与EGFP编码区之间插入带有多克隆位点的IRES序列,获得pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体,该载体可以实现在同一个启动子CMLC2的驱动下分别同时表达目的基因和EGFP;为了验证该表达载体的有效性,进一步在CMLC2启动子与IRES序列之间插入DsRed-Monome编码区,利用得到的pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP转基因载体显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎中进行表达分析,结果表明外源目的基因DsRed-Monome和报告基因EGFP均能以相同的表达模式在斑马鱼心脏组织中特异表达。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体的成功构建对于建立心脏发育候选基因的斑马鱼转基因实验模型具有重要意义。     

昆虫转座子在转基因技术中的应用

转座子是基因组中一段可移动的DNA重复片段。越来越多的研究表明,转座子是真核生物基因组的主要组成成分,是基因组和表型进化的主要动力之一,并且对基因表达调控网络的进化具有重要的贡献。由于转座子在基因组内具有可移动性,使其在生物技术和分子生物学领域备受重视,尤其在转基因技术上得到了广泛应用。本文综述了转座子在昆虫中的分布、类型及功能,重点阐述不同昆虫转座子在转基因技术中的应用,并对转基因安全性和转座子稳定性进行了讨论。     

荧光转基因斑马鱼Tg(ttn.2:EGFP)的构建

为了建立一种用于研究肌肉和心脏发育及其相关疾病的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因斑马鱼品系,本研究使用斑马鱼ttn.2基因编码区上游启动子序列和绿色荧光蛋白基因编码序列构建了重组表达载体,并将该载体和Tol2转座酶的加帽mRNA显微共注射入斑马鱼1-细胞期胚胎,通过荧光检测、遗传杂交筛选和分子鉴定等方法,成功建立了能稳定遗传的Tg(ttn.2:EGFP)转基因斑马鱼品系。荧光表达分析及原位杂交分析结果表明,绿色荧光信号在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异表达模式与ttn.2基因的mRNA表达一致。通过反向PCR鉴定转基因表达载体在F1代斑马鱼品系中的随机整合位点,结果表明:No.33转基因品系的EGFP基因整合在斑马鱼的4号和11号染色体上,No.34转基因品系则整合在1号染色体上。该荧光转基因斑马鱼品系Tg(ttn.2:EGFP)的成功构建为肌肉和心脏发育以及相关疾病研究提供了一个新的理想实验模型。此外,绿色荧光强烈表达的斑马鱼品系还可以作为一种新的观赏鱼。     

piggyBac转座子及其在转基因昆虫中的应用

piggyBac是一种从粉纹夜蛾Trichoplusiani.中分离到的、具有TTAA插入位点特异性的DNA转座子。piggyBac可在昆虫基因组中准确切离,转化频率较高,并且不受宿主因子的限制,是目前转基因昆虫研究中应用最广的转座子载体。近年来的研究发现,piggyBac类转座子广泛分布于昆虫和其他生物基因组中。文章从piggyBac的结构、转座特性、在转基因昆虫中的应用以及piggyBac类转座子的分布等几个方面综述了piggyBac的研究进展。     

Tol2转座子介导斑马鱼rps26基因附近增强子捕获及注解分析

随着人类等生物大规模基因组测序工作的完成,认识和理解基因组上表达调控元件成为后基因组时代的重要研究任务,增强子捕获技术是一种鉴定基因组上增强子元件及其对基因表达调控机制的有效方法。本研究选择Tol2转座子系统介导制备的稳定增强子捕获品系TK4系(头部和躯干特异性GFP表达),利用Splinkerette PCR(sp-PCR)、原位杂交和比较基因组学等技术手段进行所捕获增强子的解析研究。将TK4系的F1代与野生型斑马鱼杂交,收集受精卵,于6 hpf(Hour post fertilization)、24 hpf、48 hpf、3 dpf(Day post fertilization)、4 dpf、5 dpf六个发育阶段通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白报告基因的表达模式;然后通过sp-PCR方法克隆到Tol2转座子插入位点斑马鱼基因组侧翼序列,经比对分析表明插入位点位于基因组23号染色体27749253位置,在rps26基因的intron1中,且报告基因插入方向与基因方向相反。在插入位点100 kb的基因组范围内有7个基因,分别为arf3a、wnt10b、wnt1、rps26、IKZF4、dnajc22和lmbr1l。通过VISTA程序对不同脊椎动物基因组同源序列比对结果显示,在rps26基因下游有2个潜在保守的非编码序列区CNS1(Conserved non-coding sequence)和CNS2,为可能的增强子元件。胚胎原位杂交表明:rps26基因的两个转录本有母源性表达,rps26-201在合子中的表达早于rps26-001,而TK4系斑马鱼的GFP在早期(6 hpf)不表达,后期rps26与GFP的表达模式既存在相似性,也存在差异性,提示两者可能既接受共同的增强子调控,但也存在不同增强子调控,所获得的2个潜在的增强子(CNS1和CNS2)可能对附近的基因(包括rps26)发挥差异的时空表达调控作用。本研究首次成功获得rps26基因附近2个潜在增强子,为深入研究这两个增强子对基因组附近基因的表达调控机制奠定基础,本研究所采用的结合技术手段也为增强子解析提供参考。     

Tol1转座子研究进展

Tol1和Tol2是在青鳉基因组中发现的具有自主活性的DNA转座子,而Tol1转座子的自主活性是新近才发现的,因此对它的报道较少。较之Tol2,Tol1可以携带更大片段的DNA进行转座,且Tol1的转座不受转座酶"过量表达抑制"的影响。研究已证实,Tol1转座子在秀丽线虫、斑马鱼、爪蟾和人等多种生物中具有转座活性。因此,在动物转基因和基因功能研究等方面有重要的应用前景。从Tol1转座子的结构特征、转座机制和作为基因转移载体的优点,以及应用研究等方面进行了简要的综述。     

心脏特异表达绿色荧光斑马鱼模型的建立与评估

本课题组前期研究中, 利用斑马鱼cmlc2 (Cardiac myosin light chain 2)基因启动子构建了一个用于斑马鱼心脏组织特异表达外源基因的转基因表达载体pTol2-cmlc2-IRES-EGFP。文章利用该载体构建了一个稳定表达EGFP的转基因斑马鱼品系, 并初步分析了EGFP的表达对该转基因斑马鱼品系的心脏发育和功能的影响。结果表明, 在建立的转基因斑马鱼品系早期胚胎发育过程中, 绿色荧光信号在心脏中特异表达, 该表达模式与原位杂交分析的cmlc2的表达模式结果相同; 该转基因斑马鱼品系的心脏形态及发育生长正常; 进一步通过M-Mode分析心脏生理学功能的结果表明：该转基因品系心动周期、心率、收缩与舒张表面积及表面积缩短率等重要生理指标与正常野生型的斑马鱼对照组相比没有显著差别。以上结果表明该转基因品系中绿色荧光蛋白的表达对斑马鱼心脏的发育和功能没有影响。研究结果为进一步利用该载体建立外源目的基因转基因表达模型, 研究心脏表达基因的功能奠定了重要基础。     

转座子PiggyBac在哺乳动物中的应用

DNA转座子作为一种遗传工程工具已广泛应用于多物种的转基因及产生插入突变等研究。目前,在哺乳动物中有转座活性的转座子可分为三类：1）hAT样转座子;2）Tcl样转座子包括Sleeping Beauty和FrogPrince;3）PiggyBac转座子家族。其中甘蓝蠖度尺蛾（Cabbage looper moth Trichoplusia ni）来源的PiggyBac转座子是目前在哺乳动物中活性最高的转座子,并且可以携带十几kb的外源基因转座而不影响其效率,使其在哺乳动物的转基因、癌基因的发现、基因治疗研究方面具有巨大的应用潜力。此外,PB的无痕迹转座对于无转基因、无遗传物质改变的诱导多潜能干细胞（iPS）研究也具有非常重要的意义。本文主要对针对PB在哺乳动物中的应用现状及前景作一介绍。     

转座子标签法克隆分离植物基因的研究进展

转座子标签法是克隆与分离植物基因的一项十分有效的方法。概述了转座子标签技术克隆与分离植物基因的基本原理与方法 ,介绍了可用于转座子标签技术的转座子 ,对于转座子标签系统以及在克隆与分离异源植物基因方面的主要成就进行了综述 ,并对将来的研究方向进行了讨论。     

转座子标签及其在酿酒酵母基因功能研究中的应用

转座子标签(transposontagging)技术是研究功能基因的有效的工具之一。介绍了几种在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因功能研究中应用的转座子标签:mTn3标签、miniMu噬菌体标签和Ty转座子标签,阐述了转座子标签的构建原理、应用策略和转座子标签插入位点的鉴定方法。     

Transposon mutagenesis of coryneform bacteria

The Corynebacterium glutamicum insertion sequence IS31831 was used to construct two artificial transposons: Tn31831 and miniTn31831. The transposition vectors were based on a gram-negative replication origin and do not replicate in coryneform bacteria. Strain Brevibacterium flavum MJ233C was mutagenized by miniTn31831 at an efficiency of 4.3 x 10⁴ mutants per microgram DNA. Transposon insertions occurred at different locations on the chromosome and produced a variety of mutants. Auxotrophs could be recovered at a frequency of approximately 0.2%. Transposition of IS31831 derivatives led not only to simple insertion, but also to cointegrate formation (5%). No multiple insertions were observed. Chromosomal loci of B. flavum corresponding to auxotrophic and pigmentation mutants could be rescued in Escherichia coli, demonstrating that these transposable elements are useful genetic tools for studying the biology of coryneform bacteria.     

利用Tol2转座子介导的增强子诱捕技术获得血管相关转基因斑马鱼系

心血管系统形成于胚胎发育极早期并为其他器官的发育、维持、修复所必需,血管生长异常可造成多种疾病.然而,由于研究对象所限,胚胎血管的发育机制尚未完全阐明,调控血管发育的基因也所知有限.通过Tol2转座子介导的大规模增强子诱捕筛选到26个血管特异表达绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的转基因斑马鱼系,其中有一些品系在胚胎的某些特异血管结构中表达绿色荧光.通过linker-mediated PCR克隆到22个鱼系中Tol2插入位点附近的斑马鱼基因组序列,其中有17个鱼系的Tol2插入可定位到现有的斑马鱼基因组中的单一位点.通过整体胚胎原位杂交对插入位点附近的基因进行表达谱分析,得到8个表达谱与转基因鱼系一致的基因,涵盖了9个鱼系,其中dusp5基因对应于2个不同的鱼系.这8个基因中包括hhex、ets1a和dusp5等3个功能已知的基因,但是大部分(5个)基因在斑马鱼中尚无功能研究,分别为zvsg1、micall2a、arl8b(1of2)、zgc:73355以及hecw2(1of2).hhex和ets1a基因对血管与血细胞前体的发育具有重要作用,所获得的EGFP报告基因受hhex或ets1a基因增强子控制的转基因斑马鱼(mp378b和mp430c-2)为国际首例,为深入研究这两个基因在血管与血液发育中的作用机制提供了新的机遇.筛选到的功能未知基因可以用来进一步研究其在血管发育中的功能;同时,利用所获得的转基因鱼系,可以实现实时、动态观察成血管细胞的起源、分化与基因表达调控,并可用于高通量小分子药物筛选等重要研究.     

Transposon targeting determined by resolvase

The Mu-related transposon Tn5090, also called Tn402, was observed to be highly selective for targets clustered in or close to recombination sites of serine-type recombinases in plasmids R388 and RP1. Transposition to the par area of RP1 responded strongly to a deletion in the gene of resolvase ParA. A search in sequence databanks revealed further insertions of Tn5090/Tn402 close to different genes of resolvases. These results imply that the target selection of Tn5090 depends on a property that is shared among several serine recombinases.     

转座子挽救法对转座子突变菌株中插入位点的定位分析

为寻找谷氨酸棒杆菌转座子插入突变菌株中的转座子插入位点,采用了转座子挽救法对转座子及其插入位点附近的序列进行分离,并测定插入位点相邻DNA序列,获得了三个转座子插入位点DNA序列,其中一个是柠檬酸合成酶基因,另两个为目前未知基因,暂命名为orfA和orfB。该方法简便易行,是分析转座子插入位点的理想方法。     

Transposon Tn5 confers streptomycin resistance to Myxococcus xanthus

Abstract In addition to resistance to kanamycin, transposon Tn 5 confers resistance to streptomycin in Myxococcus xanthus . The streptomycin determinant is located within the Bgl II fragment of Tn 5 . The level of resistance varies among strains bearing Tn 5 insertions in different chromosomal loci and there is a correlation between the levels of resistance to streptomycin and to kanamycin.     

转座子标签法突变呋喃丹降解菌CFDS-1

通过接合使供体大肠杆菌DH5α中的质粒pSC123上的转座子插入到受体菌CFDS-1基因组DNA中,以引起该菌株的基因插入突变。利用转座子上的卡那霉素抗性基因和呋喃丹降解过程中红色物质的产生与否初步筛选出6株突变株,分别命名为CFDS—M1～CFDS—M6。紫外扫描和气谱检测结果进一步证明这些突变子确实失去了对呋喃丹的降解能力。根据转座子的序列设计引物,以6株突变株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,并对PCR产物进行限制性酶切分析,结果表明这些突变子中呋喃丹降解基因的失活就是由于转座子的插入而导致的。