红色红曲菌M7中色素聚酮合酶基因敲除突变体的鉴定

摘要:【目的】研究红色红曲菌(Monascus ruber) M7中控制红曲色素合成的聚酮合酶基因(pksPT)的功能。【方法】对M7 中pksPT进行了生物信息学分析;借助农杆菌介导的红曲菌转化技术敲除M7中pksPT,获得pksPT缺失突变体(ΔpksPT),比较M7和ΔpksPT菌落形态、产孢能力、生长速度、色素和桔霉素产量的差异。【结果】pksPT全长8687 bp,编码蛋白含有2690个氨基酸,属于非还原Ⅲ型聚酮合酶,包括β-酮酯酰基合成酶(KS)、酰基载体蛋白(ACP)、酰基转移酶(AT)和甲基转移酶(ME)四种结构域,组合形式为KS-AT-ACPACP-ME。ΔpksPT的分析结果显示,pksPT的敲除不影响其产分生孢子和闭囊壳的能力;ΔpksPT不能产生任何一种红曲色素;其生长速度明显快于野生菌株M7;桔霉素产量较M7 提高了2.8倍。【结论】pksPT是M7中控制红曲色素合成的关键基因,红曲色素的合成显著影响红曲菌产桔霉素能力和生长速度。     

红曲菌次生代谢产物生物合成途径及相关基因的研究进展

红曲菌(Monascus spp.)是我国重要的药食两用微生物资源之一,能够产生天然食品添加剂红曲色素、降血酯活性物质Monacolin K等有益次生代谢产物,但也能分泌真菌毒素桔霉素(Citrinin),红曲菌及其相关产品的安全性由此受到质疑.因此,如何促进红曲菌有益代谢产物的产生,减少或抑制桔霉素的产生成为广大科研工作者研究的重点方向.近年来,红曲菌的分子生物学研究有了较快的发展,红曲菌次生代谢产物生物合成及其调控的研究是热点.本文重点介绍红曲色素、Monacolin K和桔霉素生物合成途径及相关基因的研究进展,以期为有效调控红曲菌次生代谢产物的产生、提高红曲产品的安全性提供参考和借鉴.     

色素生物合成相关PigE基因的缺失对紫色红曲霉Mp-21黄色素种类和产量的影响

红曲色素（MPs）是红曲霉次生代谢过程中产生的具有多种生物活性的天然色素,广泛应用于食品、化妆品和保健品行业。[目的]本研究从紫色红曲霉Mp-21中克隆了一个红曲色素产生相关PigE基因,并对其功能进行了鉴定。[方法]利用同源重组原理对PigE基因进行敲除,从表型、显微结构、生长速率、红曲色素、桔霉素等方面分析基因缺失前后的生物学特征变化。[结果]PigE基因的缺失主要导致黄色素产量的提高和种类的增多。与野生型Mp-21菌株以产生红色素为主的色素混合物相比,△PigE丧失了产生红色素的能力,并且新产生了至少5种新的黄色素。△PigE液体发酵13 d后,红曲色素的总色价达到了3548.2 U/g,约为野生型Mp-21菌株的4.82倍;而△PigE桔霉素的产量没有显著变化,但产生的时间延迟。[结论]PigE基因的缺失可能阻断了黄色素向橙色素的转化途径,使△PigE更趋向于黄色素的形成。由于红色素的形成需要较复杂的条件,如培养基中的氨基酸和适宜的pH值等,△PigE更倾向于先合成黄色素,丧失了产生红色素的能力。本研究为高产黄色素基因工程红曲霉菌株的构建提供了一种可能的途径。     

色素生物合成相关PigE基因的缺失对紫色红曲霉Mp-21黄色素种类和产量的影响（英文）

红曲色素(MPs)是红曲霉次生代谢过程中产生的具有多种生物活性的天然色素,广泛应用于食品、化妆品和保健品行业。【目的】本研究从紫色红曲霉Mp-21中克隆了一个红曲色素产生相关PigE基因,并对其功能进行了鉴定。【方法】利用同源重组原理对PigE基因进行敲除,从表型、显微结构、生长速率、红曲色素、桔霉素等方面分析基因缺失前后的生物学特征变化。【结果】PigE基因的缺失主要导致黄色素产量的提高和种类的增多。与野生型Mp-21菌株以产生红色素为主的色素混合物相比,△PigE丧失了产生红色素的能力,并且新产生了至少5种新的黄色素。△PigE液体发酵13 d后,红曲色素的总色价达到了3548.2 U/g,约为野生型Mp-21菌株的4.82倍;而△PigE桔霉素的产量没有显著变化,但产生的时间延迟。【结论】PigE基因的缺失可能阻断了黄色素向橙色素的转化途径,使△PigE更趋向于黄色素的形成。由于红色素的形成需要较复杂的条件,如培养基中的氨基酸和适宜的pH值等,△PigE更倾向于先合成黄色素,丧失了产生红色素的能力。本研究为高产黄色素基因工程红曲霉菌株的构建提供了一种可能的途径。     

红曲霉T-DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选*

以农杆菌介导法建立的红曲霉T-DNA转化库为实验材料,采用抑菌圈法从5,000多个转化子中筛选出200株桔霉素突变子的候选菌株,用高效液相色谱法进一步筛选得到53株与出发菌株相比产桔霉素能力发生显著变化的突变子,其红曲中桔霉素含量介于0·04~154·57μg/g之间。进一步分析了突变子的红曲色价,发现突变子产桔霉素能力与产色素能力之间有一定的相关性。这些研究结果为进一步从分子水平上探讨红曲霉产桔霉素和色素等次生代谢产物之间的关系提供了材料和基础。     

红曲霉T-DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选

以农杆菌介导法建立的红曲霉T—DNA转化库为实验材料,采用抑菌圈法从5,000多个转化子中筛选出200株桔霉素突变子的候选菌株,用高效液相色谱法进一步筛选得到53株与出发菌株相比产桔霉素能力发生显著变化的突变子,其红曲中桔霉素含量介于0．04～154．57μg／g之间。进一步分析了突变子的红曲色价,发现突变子产桔霉素能力与产色素能力之间有一定的相关性。这些研究结果为进一步从分子水平上探讨红曲霉产桔霉素和色素等次生代谢产物之间的关系提供了材料和基础。     

红色红曲菌M7核型分析与桔霉素、色素基因簇的染色体定位

以红色红曲菌Monascus ruber M7菌株为研究对象,对其核型进行分析,并将桔霉素与色素合成基因簇定位于染色体。通过原生质体制备,以脉冲场凝胶电泳进行核型分析。在此基础上,通过Southern杂交将桔霉素与色素合成基因簇定位于染色体。脉冲场凝胶电泳结果显示,红色红曲菌M7包含大小依次为4.9,4.3,3.7,3.4,3.0,2.3,2.1Mb的7条(I-VII)染色体,基因组大小约为23.7Mb。Southern杂交结果表明,桔霉素合成基因簇位于第IV条染色体上,色素合成基因簇位于第V条染色体上。     

红曲霉菌液相培养高产色素低产桔霉素的代谢调控研究

从8株固态发酵高产红曲色素菌株中筛选出一株适合于液相培养工艺的高产红曲色素菌株FL1,并对其液相培养过程特性及高产色素低产桔霉素的代谢调控策略进行了研究.发酵过程动力学研究结果表明,红曲色素与桔霉素作为次级代谢产物,其合成与红曲霉菌生长的关系属于非生长偶联型.本文首次采用连续补料的Fed-Batch培养技术,用于红曲霉...     

红曲菌cDNA消减文库的构建*

应用抑制性消减杂交技术,构建红曲菌产桔霉素和不产桔霉素差异表达的cDNA消减文库。分别从产桔霉素和不产桔霉素的红曲菌丝体中提取mRNA,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成大小为250~750bp的片断,将产桔霉素的cDNA分为两组,分别与两种不同的接头连接,再与不产桔霉素的红曲菌的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,文库扩增后得到283个克隆,经PCR法快速测定,均得到250~750bp的插入片断。所构建的红曲菌cDNA消减文库为进一步筛选红曲菌中与产桔霉素性状相关的基因奠定了基础。     

红曲菌 cDNA 消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术,构建红曲菌产桔霉素和不产桔霉素差异表达的 cDNA 消减文库。分别从产桔霉素和不产桔霉素的红曲菌丝体中提取 mRNA,依次合成单链和双链 cDNA,经酶切成大小为 250～750bp 的片断,将产桔霉素的 cDNA 分为两组,分别与两种不同的接头连接,再与不产桔霉素的红曲菌的 cDNA 进行两次消减杂交及两次抑制性 PCR 后,将产物与 T/A 载体连接构建成功 cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,文库扩增后得到 283 个克隆,经 PCR 法快速测定,均得到 250～750bp 的插入片断。所构建的红曲菌 cDNA 消减文库为进一步筛选红曲菌中与产桔霉素性状相关的基因奠定了基础。     

Real-time quantitative analysis of the influence of blue light on citrinin biosynthetic gene cluster expression in Monascus

When Monascus MX was grown under blue light instead of in the dark, citrinin production increased from 478?mg?l(-1) to 698?mg?l(-1). To explain this, the expression of the pksCT gene, which encodes citrinin polyketide synthase, and of 5 ORFs around it, were monitored. Blue light enhanced citrinin production by upregulating the expression of orf1, orf3, and orf4, indicating that pksCT was not the key gene responsible for the quantity of citrinin production in blue light.     

Pigments and citrinin biosynthesis by fungi belonging to genus Monascus

Citrinin is a mycotoxin, which is produced by fungi belonging to the genus Monascus, known in biotechnology as producers of azaphilone pigments. The relation between biosynthesis of these secondary metabolites was investigated in different species of the genus Monascus in batch-culture at the following cultivation conditions: T = 28 degrees C, agitation 220 rpm, and a medium, which induce citrinin production, containing ethanol as a carbon source. The screening was carried out with 16 fungal strains and the biosynthesis of citrinin and pigments was monitored quantitatively at the standard conditions mentioned above. Some kinetic parameters of the process have been determined. The values of the growth yield coefficient Y(X/C) were between 0.32 and 0.57. The amount of the extracellular red and orange pigments at the end of cultivation varied for the different strains between 0.09 and 1.33 OU/ mg dry weight, and 0.15 and 0.96 OU/mg dry weight, respectively. The amount of the total pigments measured was between 0.16 and 3.6 OU/mg dry weight, and between 0.21 and 3.39 OU/mg dry weight. The determined ratio 500 nm/400 nm, characterizing the pigment production, ranged between 0.60 and 1.06. Twelve of the investigated strains produced citrinin and pigments, two of them produced only pigments. Two strains were not able to produce neither pigments nor citrinin. Thus, the biosynthesis of citrinin appeared to be strain-specific and does not correlate with the pigments' biosynthesis by the fungal strains belonging to the genus Monascus.     

农杆菌介导的红曲菌T-DNA插入突变库的构建及色素突变子的性质分析

以农杆菌EHA105为介导,将带有潮霉素抗性基因和gus基因的T-DNA片段转化到红色红曲菌(Monascusruber)中。通过转化条件的优化,成功构建了含有5132个转化子的T-DNA插入突变库。根据菌落颜色与色素分泌情况筛选到50株色素突变子,聚合酶链式反应(PCR)表明上述突变子均有T-DNA片段插入。经5代的继代培养后,94%的突变子具有稳定性(潮霉素抗性)。对突变子产色素和桔霉素能力的分析表明其分泌次生代谢产物的能力发生了较大变化。本方法的建立,为进一步深入研究红曲菌的代谢调节和基因功能奠定了基础。     

高产γ-氨基丁酸低产桔霉素红曲霉(Monascus ruber)突变子1047筛选与发酵特性研究

以红曲米中筛选到的红色红曲霉菌株G为原始菌株,通过农杆菌介导T-DNA插入突变技术,成功构建了含有1 483株红曲霉突变子的T-DNA插入突变库。用HPLC等方法从突变库中筛选出10株γ-氨基丁酸(GABA)产量稳定高于原始菌株G的突变子,薄层层析结合HPLC技术分析了10株突变子发酵液中桔霉素的含量;其中突变子1047的GABA产量较高,为1.169g/L,是原始菌株G(GABA产量0.472g/L)的247.67%,桔霉素含量稳定低于原始菌株G。以红曲霉菌株G和突变子1047为实验材料,通过5 L发酵罐发酵并定时取样,HPLC等方法精确分析发酵液各种活性物质的含量;结果显示,突变子1047生长速度稍快于原始菌株G;GABA、莫纳可林K(Monacolin K)、红曲色素色价分别为2.201 g/L、83.892 mg/L、21.984 U/mL,是原始菌株G的279.67%、108.01%和182.35%;而桔霉素产量为1.976 mg/L,是原始菌株G的41.71%。因此,利用TDNA插入的方法对红曲霉进行育种,能产生稳定的遗传变化,在红曲霉资源的保护和利用上有一定潜力。     

红曲霉桔霉素的检测方法及红曲霉产桔霉素的判别方法*

建立了红曲霉真菌毒素桔霉素的HPLC检测方法。用谷氨酸和葡萄糖为唯一氮、碳源的培养基(MSG)液态摇瓶培养及红曲米固态培养,对30多株红曲霉产桔霉素的情况进行了普查,发现大多数红曲霉菌种可产生桔霉素。红曲霉的培养状态及条件对桔霉素的产生有重大影响。红曲霉菌种是否产桔霉素,可根据MSG培养基摇瓶发酵液中是否含有桔霉素来初步定性判断,为准确判断红曲霉菌是否产桔霉素,可采用多种培养法综合判断。     

红曲霉T-DNA插入突变库中色素突变子的筛选

红曲霉（Monascus purpureus）是我国重要的传统食用和药用微生物,能分泌红曲色素、莫纳卡琳（Mo-nacolin K）、γ-氨基丁酸、麦角固醇等物质,被广泛用于生产食品发酵剂、食品着色剂、保健食品和药品等,在我国有上千年的应用历史。本实验以根癌农杆菌（Agrobacterriumtum efaciens）介导的红曲霉突变体库中754株突变子菌株为材料,通过乙醇提取法筛选出了9株产红曲色素发生显著变化的色素突变子,其中S50在505 nm波长处的色价降为原始菌株S的0.12倍,几乎变为白化株。300~600 nm波长下UV-VIS扫描图谱特征显示,色素突变子不仅色价发生了变化,而且吸收波长、吸收峰值也发生了不同程度的变化。最后,对色素突变子菌落形态、显微结构、潮霉素抗性、遗传稳定性以及产桔霉素能力等进行分析,为研究红曲霉产色素相关基因奠定了基础。