利用细菌表达dsRNA介导黄粉虫抗冻蛋白基因的RNA干扰

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是研究基因功能的一种重要工具。为了利用RNAi技术对黄粉虫抗冻蛋白(Antifreeze protein,AFP)基因的非抗冻功能进行验证,将黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433的相应干扰片段构建至L4440干扰载体并转化大肠杆菌HT115(DE3)菌株,利用IPTG诱导表达特异的afp基因相应dsRNA,纯化后注射黄粉虫幼虫,通过实时荧光定量PCR检测afp基因在mRNA水平的变化。结果显示含有L4440-Tmafp重组质粒的HT115菌株可以表达干扰afp基因的dsRNA,命名为Tmafp-dsRNA。用Tmafp-dsRNA注射黄粉虫24 h后,Tmafps的表达受到显著抑制,相比对照下降了60.8%。本研究表明通过注射dsRNA可有效抑制黄粉虫afp基因的表达。     

细菌表达dsRNA介导的家蚕FTZ-F1基因的RNA干扰

为探索细菌表达目标基因dsRNA介导的RNAi技术是否在家蚕Bombyx mori可行, 本研究引入了在其他物种中广泛应用的细菌表达dsRNA的RNAi系统: HT115细菌株和L4440质粒。利用L4440载体两端含有T7启动子的特点, 设计并构建了针对家蚕核受体FTZ-F1基因的RNA干扰（RNA interference）载体, 将构建好的质粒转入大肠杆菌Escherichia coli HT115, 在IPTG诱导下成功获得目标基因对应双链RNA（dsRNA）。 结果显示: 通过对5龄第7天家蚕幼虫注射IPTG诱导后提取的FTZ F1基因对应的dsRNA 25 μg, 85%的蛹变态发育过程明显延迟, 不能实现幼虫到蛹的形态完全转变。荧光定量PCR分析显示目标基因的表达得到了特异的抑制。实验结果初步表明, 通过细菌表达目标基因dsRNA介导的RNAi策略, 以其经济、高效的特点, 具有广泛应用于家蚕基因功能研究中的潜力。     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的:构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法:荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果:在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论:成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的：构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法：荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果：在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论：成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

细菌介导的RNA干扰对C.elegans中par-3基因的作用

设计并构建了针对par-3基因的发夹RNA载体，将构建好的质粒转入大肠杆菌HT115，25℃喂食Caenorhabditis elegans（C.elegans）野生型虫体，24h后观察par-3（RNA干扰）celegans的胚胎发育情况。结果显示通过喂食形成发夹结构dsRNA的细菌可以对celegans中par-3基因进行RNA干扰，干扰率可以达到60％以上。干扰后的早期胚胎发育丧失第一次卵裂的不对称性，第二次卵裂的纺锤体方向发生改变，与par-3突变体的观察结果一致，为进一步在mex-3转基因虫体中通过RNA干扰研究基因表达打下了基础。     

小鼠RNA干扰RelA基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法:针对小鼠Rel A基因序列,设计特异性的sh RNA序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T细胞,得到目的病毒并测定相应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1细胞后,Real-time PCR及Western blot检测MC3T3-E1细胞Rel A基因及成骨相关基因ALP、OCN、RANKL的表达。结果:成功构建小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1细胞后,Rel A基因的表达明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论:成功构建了小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞Rel A基因表达被干扰,NF-κB通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。     

小鼠RNA干扰基因RelA慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建小鼠RelA 基因的RNA 干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法：针对小鼠RelA 基因序列,设计特异 性的shRNA 序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5-alpha,筛选得到阳性克隆 并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T 细胞,得到目的病毒并测定相 应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1 细胞后,Real-time PCR 及Western blot 检测MC3T3-E1 细胞RelA 基因及成骨相关基因 ALP、OCN、RANKL的表达。结果：成功构建小鼠RelA 基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1 细胞后,RelA 基因的表达 明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论：成功构建了小鼠RelA 基因的 RNA 干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞RelA基因表达被干扰,NF-资B 通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的 表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL 的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。     

乙酰肝素酶重组慢病毒转基因和siRNA干扰质粒的构建及鉴定

目的：构建乙酰肝素酶重组慢病毒转基因和siRNA干扰质粒,为探讨HPSE在在肿瘤浸润转移过程中的分子机理奠定基础。方法：乙酰肝素酶cDNA全长扩增和最佳siRNA干扰片段筛选分别采用PCR和Real-time PCR方法,慢病毒系统载体分别使用pWPI和siRNA pSico系统,采用限制性内切酶快速连接方法联接目的基因和最佳最佳siRNA干扰片段,表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,HPSE重组慢病毒表达质粒和siRNA片段细胞转染采用脂质体转染法。结果：成功扩增乙酰肝素酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体HPSE-pWPI,重组质粒测序结果显与HPSE基因的同源性达99%。转染293T后有HPSE基因的表达。筛选出最佳siRNA干扰片段为HPSE-1222并成功插入pSico载体,构建成重组表达载体HPSE-siRNA pSico,重组载体测序显示与构建的shRNA结构序列完全一致。结论：成功采用慢病毒载体系统构建了乙酰肝素酶重组慢病毒转基因和siRNA干扰质粒,为探讨HPSE在在肿瘤浸润转移过程中的分子机理奠定基础。     

人线粒体转录终止因子3基因RNA干扰表达载体的构建筛选与干扰效果评价

目的:构建人线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达载体,并在mRNA和蛋白质水平对其干扰效率进行验证,以检测和筛选出干扰效率最优的shRNA表达载体。方法:根据人MTERF3基因全长cDNA序列,利用Oligoengine在线软件设计4个shRNA序列,合成4条互补寡核苷酸链,退火成双链后克隆至psiU6.1载体,得到4个重组干扰质粒psi-MTERF3-1～psi-MTERF3-4,并通过PCR和DNA测序对其进行鉴定;将重组干扰质粒利用脂质体介导瞬时转染He La细胞,转染48 h后采用real time RT-PCR检测4个干扰质粒对MTERF3 mRNA表达水平的影响,采用Western印迹检测其对MTERF3蛋白表达水平的情况,并筛选出最有效的shRNA干扰质粒。结果:PCR鉴定和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列;real time RT-PCR和Western印迹结果表明4个重组载体均可以显著降低人MTERF3基因mRNA和蛋白质的表达水平(P0.05),其中以pSi-MTERF3-4的干扰效率最优,对MTERF3 mRNA表达的抑制率为70.1%,对MTERF3蛋白表达的抑制率为72.2%。结论:在人宫颈癌He La细胞系筛选出有效干扰MTERF3基因表达的shRNA序列,构建了针对MTERF3基因的RNA干扰真核表达载体且能够有效抑制目的基因的表达,为进一步研究人MTERF3在宫颈癌发生发展中的作用机制提供了实验基础。     

二化螟碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶基因RNA干扰技术体系的优化

【目的】比较不同方法以及不同靶标基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)效率,建立并优化二化螟Chilo suppressalis碱性神经酰胺酶saCER和中性鞘磷脂酶snSMase基因的RNAi的技术体系。【方法】通过培养液浸泡法将果蝇Drosophila daCER基因的dsRNA导入果蝇S2细胞内;分别通过显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法将体外合成的二化螟saCER和snSMase基因的特异性双链RNA(dsRNA)导入二化螟3龄(注射法)和2龄(喂食法)幼虫体内,之后利用qPCR测定靶标基因的mRNA表达水平,比较不同方法对不同基因的RNA干扰效率。【结果】将果蝇S2细胞浸泡在浓度为15 ng/μL的含daCER dsRNA细胞培养液中培养72 h后,daCER基因的表达水平下降了约84%。dsRNA (5 000 ng/μL)注射二化螟3龄幼虫60 h后对saCER基因的干扰效率达到最高(41%),dsRNA (2 500 ng/μL)注射48 h后对snSMase基因的干扰效率最高(47%);给二化螟2龄幼虫喂食dsRNA(48μg/d)后,分别在第7天和第8天对saCER(32%)和snSMase(52%)基因达到最大干扰效率。对于aCER基因,果蝇S2细胞浸泡法与二化螟注射法和喂食法相比,干扰效率差异极其显著;使用相同方法,对saCER基因和snSMase基因的干扰效率无显著差异;对于二化螟的同一基因(saCER或者snSMase),注射法与荧光纳米粒子喂食法之间干扰效率也无显著性差异。【结论】碱性神经酰胺酶基因和中性鞘磷脂酶基因对导入dsRNA进行RNAi的方法较敏感,本研究建立并优化的显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法RNAi技术体系在鞘脂质代谢酶基因功能的基础研究中具有可行性。注射法和喂食法对二化螟幼虫aCER基因的干扰效率远低于浸泡法对果蝇S2细胞中这一基因的干扰效率,进一步证实二化螟血淋巴中的RNA酶对dsRNA的快速降解以及中肠围食膜的阻隔很大程度上削减了dsRNA进入二化螟细胞内发挥干扰作用。     

应用载体介导的RNAi技术抑制胰腺癌细胞K-RASAsn12的表达

为了研究载体介导的RNAi（RNAinterference）技术特异地抑制K-RASAsn12。（K-RAS第12位密码子突变形式为GAT）在胰腺癌细胞中的表达,合成两条编码针对K-RASAsn12。突变特异性短发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA）序列的单链DNA,并将其克隆到pSilenCircle栽体中,构建含目的基因片段的重组质粒pSC-K-RASAsn12。同法构建含GFP基因片断的重组质粒pSC-GFP做为对照。用其分别瞬时转染人胰腺癌AsPC-1细胞和BxPC-3细胞后,经半定量RT-PCR和Westernblot检测K-RAS的表达水平。结果表明构建的针对K-RASAsn12的编码突变特异性shRNA的质粒表达载体可特异的抑制胰腺癌细胞的K-RASAsn12。表达,但对野生型的K-RAS（K-RASwT）表达无影响。     

人ANKRD49基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究和RNA干扰靶点的鉴定

目的: 克隆人ANKRD49基因并构建其真核表达重组体,利用构建成功的ANKRD49真核表达重组体对其进行功能的初步研究,并筛选和鉴定其RNA干扰靶点. 方法: 提取人肺腺癌细胞株A549总RNA,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对ANKRD49进行扩增,扩增产物与真核表达载体p3×Flag-CMV-14同时进行双酶切,酶切产物连接后转化入感受态细胞Top10,阳性重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法(Lipofectamine^TM 2000)转染人胚肾细胞(HEK 293T),免疫印迹(Immunoblotting)和免疫荧光技术检测表达产物.免疫荧光法检测ANKRD49在宿主细胞内的定位.MTT法检测ANKRD49对宿主细胞的增殖作用.设计并合成针对人ANKRD49基因的RNA干扰靶点序列,与p3×Flag-CMV-14/ANKRD49共转染HEK 293T细胞后,Immunoblotting鉴定ANKRD49的RNA干扰靶点. 结果: RT-PCR结果显示,从A549细胞中扩增出约720 bp的片段.菌液PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49构建成功且序列正确.免疫荧光和Immunoblotting结果显示,在转染p3×Flag-CMV-14/ANKRD49的细胞中有ANKRD49的表达,蛋白质相对分子质量(Mr)约为27kDa,而转染空质粒组未见表达.MTT结果显示,ANKRD49对细胞增殖没有影响.共转染实验结果显示,1号和4号RNA干扰序列可以有效降低人ANKRD49的表达. 结论: 成功构建了真核表达重组体p3×Flag-CMV-14/ANKRD49,该蛋白质位于细胞核,不参与细胞增殖;同时鉴定出该基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究其功能奠定了基础.     

短发夹 RNA 介导 RNA 干扰的时间 和剂量效应研究

用 RNA 干扰 (RNA interference , RNAi) 技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达,以探讨该过程中 RNAi 作用的剂量和时间效应 . 应用 Lipofectamine 2000 将外源报告基因的表达载体与编码短发夹 RNA (short hairpin RNA , shRNA) 的质粒共转染 HEK293H 细胞,观察 shRNA 载体对报告基因的抑制效应 . 转染后, shRNAs 的瞬时表达可特异地抑制细胞内报告基因的表达 . 在共转染后 12 , 24 , 48 , 60 , 72 , 96 h 时检测 EGFP (enhanced green fluorescent protein , EGFP) 基因 mRNA 及蛋白质表达水平,结果显示, EGFP mRNA 及蛋白质表达在 12 h 时略有降低, 24~48 h 时表达逐渐降低, 48~72 h 时降低最明显,其后 EGFP 表达水平逐渐恢复 . 提示该过程中 RNAi 效应呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势 . 共转染一系列剂量比例的 EGFP 干扰载体与靶载体的结果表明,在一定剂量范围内, RNA 干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关,当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时,抑制效应则维持在一“平台期” . 此外,通过 RNAi 抑制 HeLa 细胞、 HEK293 细胞中荧光素酶基因的表达, 荧光素酶活性变化也表现出上述类似的效应 . 这些结果表明,在体外哺乳动物细胞中,基于表达载体的 RNAi 作用呈现剂量和时间依赖性效应 . 这为基于载体表达的 RNAi 技术应用研究提供了一定的理论参考及依据 .     

应用H1-U6双启动子RNAi载体筛选人泛素结合酶hUBE2W的RNAi有效靶点

hUBE2W是新近鉴定出的一种Ⅰ型泛素结合酶,可能在肿瘤发生和DNA损伤修复过程中起重要作用.RNA干涉是指通过形成局部双链RNA进而特异性地降解细胞内同源基因mRNA的机制,目前已成为基因功能研究的有力工具.通过构建H1-U6双启动子RNAi载体,可以在体内直接转录出针对hUbe2w基因的两段互补小RNA,更接近于生理状态下小干涉RNA的作用.利用RT-PCR方法从293FT细胞总RNA中扩增出hUbe2w基因,分别将其连接至质粒pGL3-Control,pCMV-myc和pDsRed-express-C1中,以便在mRNA水平和蛋白水平检测RNA干涉效果.RNA干涉载体分别与上述报告载体共转染293FT细胞,测定萤光素酶活性和hUBE2W蛋白表达水平,结果显示靶点125和259能够在mRNA水平和蛋白质水平显著降低hUbe2w的表达.     

Development of an efficient recombinant mosquito densovirus-mediated RNA interference system and its preliminary application in mosquito control

The Aedes aegypti densovirus (AeDNV) has potential as a delivery vector for foreign nucleic acids into mosquito cells. In this study, we investigated the ability of plasmids containing recombinant viral transducing genome to induce RNA interference (RNAi) effects in C6/C36 cells. We then evaluated the efficiency of a recombinant AeDNV vector to induce RNAi in Aedes albopictus larvae. We found that the expression of V-ATPase was inhibited by up to 90% at 96 h post-transfection in transfected C6/C36 cells. In addition, the bioinsecticidal activities of various RNAi-expressing AeDNV vectors used to infect Ae. albopictus larvae were also tested. We found that when Ae. albopictus larvae were infected with recombinant AeDNV, expression of V-ATPase was downregulated by nearly 70% compared to controls. Furthermore, the median survival time bioassays demonstrated that recombinant AeDNV caused more serious pathogenic effects than the wild type virus. This is the first report showing that recombinant virus plasmid and corresponding recombinant AeDNV can be used as an effective in vitro and in vivo RNAi delivery system, respectively.     

Construction of a long hairpin RNA expression library using Cre recombinase

A large number of genome-wide screens using RNA interference (RNAi) libraries have been utilized to determine the function of individual gene products involved in a variety of biological processes. In this study, we describe a new method to enzymatically generate a long hairpin RNA (lhRNA) expression library from a cDNA plasmid library using a nicking endonuclease, BcaBEST DNA polymerase, and Cre recombinase without excising the inserted DNA fragment from the plasmid vector. This method involves 5 steps: (1) conversion of an inserted DNA fragment in a plasmid into a direct repeat (DR); (2) purification of the plasmid containing the DR; (3) subcloning a lox71 cassette into the plasmid; (4) conversion of the DR in the plasmid into an inverted repeat (IR) using Cre recombinase; and (5) purification of the plasmid containing the IR. We also established an efficient method for inserting DNase I-digested DNA fragments into expression plasmids to enable construction of a cDNA plasmid library suitable as source materials to construct the lhRNA expression library. We confirmed that each of the lhRNA expression plasmids constructed using this method induced strong RNAi in a silkworm cell line, NIAS-Bm-oyanagi2.     

Bcl-2/C-Raf双基因“敲低”抑制人结肠癌细胞增殖

 RNA干扰是一种具有序列特异性的基因沉默,能够触发具有相应序列的mRNA的降解.构建具有双靶点的RNAi质粒表达载体,与单靶点表达载体比较,探讨其对结肠癌细胞增殖的抑 制作用.本研究分别构建了针对Bcl-2、C-Raf 和Bcl-2/C-Raf靶基因的质粒表达载体,通过Lipofectamine TM2000介导转染人结肠癌细胞系HCT-8后,检测相应转染组靶基因的mRNA和蛋白质表达量,测定各组细胞活性,研究RNAi对各组癌细胞增殖的抑制率.结果表明,分别转染3种质粒表达载体后,3组结肠癌细胞中相应靶基因的mRNA和蛋白质表达量均降低;转染双靶点干扰质粒的试验组;其细胞活性低于单靶点组;对于针对Bcl-2, C-Raf和Bcl-2/C-Raf基因的3组干扰实验,RNAi对结肠癌细胞增殖的抑制率分别为43.87%,40.64% 和63.85%.RNAi是结肠癌细胞中的一种功能途径,以质粒作为表达载体,同时具备Bcl-2/C-Raf双靶点的表达载体,对结肠癌细胞增殖的抑制作用要明显优于单靶点表达载体,双靶点质粒表达载体在结肠癌的基因治疗中是有潜力的.