猪α-1,3-半乳糖转移酶基因打靶载体的构建

目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaⅠ和ClaⅠ位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3'端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotⅠ位点插入该质粒中neo基因的5'端;2.7kb的负筛选标记tk基因位于载体中同源短臂的3'端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。     

副猪嗜血杆菌检测技术研究进展

副猪嗜血杆菌是存在于健康猪上呼吸道的一种致病菌,也是格拉泽氏病的病原,近年来其发生与流行给养猪业造成巨大的经济损失,现已成为危害养猪业较严重的细菌性疾病之一.及时、准确地检测出该病以便采取相应的措施,是成功防制该病的关键.本文就从血清学、病原学、分子生物学等方面阐明了副猪嗜血杆菌的检测技术,从而为兽医临床诊断与治疗提供参考.     

丙酸杆菌基因敲除体系的构建及其应用

目的 丙酸杆菌基因敲除体系的构建及其验证.方法 利用PCR技术扩增丙酸杆菌hemE基因上、下游约500 bp左右片段,构建由上下游同源臂及hygB抗性基因组成的打靶质粒pPK705-arms-hygB.将打靶质粒转入丙酸杆菌感受态细胞,利用同源重组技术定向敲除hemE基因,并通过连续传代培养,消除外源质粒.最后,利用PCR技术验证丙酸杆菌染色体和打靶质粒发生同源重组.结果 成功敲除了丙酸杆菌hemE基因.结论 打靶质粒pPK705-arms-hygB能够与宿主基因组DNA发生重组,对稳定地改善其整个代谢途径的研究奠定了方法学基础.     

副猪嗜血杆菌蜂胶苗的制备及免疫效果试验

目的：以原场副猪嗜血杆菌为制苗菌株,制成自家细菌苗,预防本场猪格拉泽氏病。方法：用从河南济源一自繁自养大型养猪场发病猪分离到的副猪嗜血杆菌进行培养,经甲醛灭活,以蜂胶为佐剂,制成原场副猪嗜血杆菌灭活苗,含菌量为200亿/ml。母猪分别于产前30d和15d各注射4ml/头。仔猪出生后,分别在15、30日龄肌肉注射,1.5ml/头。结果：应用试验证明,该灭活苗保护率达98%。结论：该蜂胶苗安全、可靠,对猪格拉泽氏病有较好的预防作用。     

副猪嗜血杆菌ompP2 基因的结构特征及其与毒力的联系

副猪嗜血杆菌ompP2 基因存在两种结构类型, 但其生物学意义人们还不清楚. 本实验
旨在进一步分析副猪嗜血杆菌ompP2 基因的结构特征并研究其与毒力的联系. 测序结果表明,
与参考菌株血清1, 3, 6, 7, 8, 9, 11 型相比, 19 株临床分离株及血清型2, 4, 5, 10, 12, 13, 14, 15 的
参考菌株的ompP2 基因存在两处连续碱基缺失, 分别位于450~524 和770~844 bp 范围内, 共
计100 bp 左右, 对81 株临床分离株的PCR 检测进一步证实此结果. 序列分析发现, 由于碱基
的连续缺失导致ompP2 基因表面暴露环减少一个, 但却使暴露于膜外的抗原决定簇个数增加,
并且临床分离株和所有毒力参考菌株中均有一个相同的、无毒菌株所没有的膜表面抗原决定簇
VTDQ(K)ALGVGL, 提示暴露于膜外的抗原决定簇可能与毒力相关. 构建两种基因结构类型
的真核表达载体转染Marc145 细胞, 结果显示碱基缺失的血清5 型ompP2 基因编码蛋白的细
胞毒性显著强于血清11 型, 首次证明ompP2 基因结构特征与毒力的关系.     

副猪嗜血杆菌aroA基因鉴定及遗传进化分析

[目的]细菌aroA基因参与芳香族氨基酸的生物合成,被成功应用于细菌分类和基因失活致弱突变菌株的构建.副猪嗜血杆菌(Hps)是感染猪出现多发性浆膜炎和关节炎的一种病原细菌,鉴定该菌aroA全基因序列将有助于鉴定遗传进化关系和突变分析.[方法]利用PCR和细菌基因组步移技术鉴定Hps的aroA基因序列,进而对不同血清型菌株该基因序列进行鉴定,并与其它革兰氏阴性细菌进行比对和遗传进化分析.[结果]自Hps血清5型基因组DNA中获得包含完整aroA基因的3.7 kb基因片段,其中aroA基因全长1314 bp,编码产物长度437 aa,分子量大小47.9 kDa,该基因上游为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因.自本试验选择的Hps不同血清型菌株中均可扩增出包含完整aroA基因的1476 bp片段,且这些不同血清型菌株间核酸序列同源性在97.7%以上.Hps血清5型aroA基因序列与巴氏杆菌科其它成员核酸序列同源性为70.6%-78.9%,与E.coli和S.typhi-murium的同源性分别为66.4%和67.2%.[结论]本试验首次对Hps的15个血清型国际参考菌株及地方分离株aroA全基因序列进行了鉴定,序列比较结果显示aroA基因在革兰氏阴性细菌中具有较高的同源性.aroA基因鉴定对构建基因失活突变菌株以研究Hps生物学特性奠定了基础.     

猪IGF-I基因荧光定量PCR标准曲线的建立

目的建立用荧光定量PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.方法根据自己克隆的猪IGF-Ⅰ(GenBankNo.DQ784687)基因mRNA序列,设计合成引物和探针,采用Taqman探针荧光定量RT-PCR的检测方法,构建检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.结果由pMD-18TIGF-Ⅰ所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102～1×106拷贝猪IGF-Ⅰ基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠.结论成功构建了用荧光定量RT-PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.     

利用CRISPR/Cas9技术建立OXTR基因敲除猪胎儿成纤维细胞系

利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系(porcine fetal fibroblasts,PFFs),为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利用在线设计工具设计了2个靶向猪OXTR外显子区的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中,最后将打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单克隆细胞,测序鉴定其基因型。生物信息学分析显示人和猪OXTR基因进化距离较近,氨基酸序列一致性达到91%,相似性为93%,三维结构的RMSD值为0.009。成功构建OXTR基因的Cas9/sgRNA打靶载体,转染PFFs细胞后,药物筛选获得OXTR基因敲除的单克隆细胞并测序证实了基因突变型。人和猪OXTR基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体高效实现了OXTR基因编辑,成功获得基因敲除的单细胞克隆,为后续构建OXTR敲除的巴马猪模型奠定了前期基础。     

猪IGF-Ⅰ基因荧光定量PCR标准曲线的建立

目的:建立用荧光定量PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。方法:根据自己克隆的猪IGF-Ⅰ(GenBankNo.DQ784687)基因mRNA序列,设计合成引物和探针,采用Taqman探针荧光定量RT-PCR的检测方法,构建检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。结果:由pMD-18T IGF-Ⅰ所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102~1×106拷贝猪IGF-Ⅰ基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠。结论:成功构建了用荧光定量RT-PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。     

绒山羊FGF5基因打靶载体的构建

[目的]构建绒山羊FGF5基因打靶载体,以期获得基因敲除的绒山羊个体,为研究绒山羊FGF5基因的功能以及培养长绒毛型绒山羊新品种提供新思路。[方法]通过PCR法扩增并克隆了绒山羊FGF5基因启动子区和部分第一外显子的1.6 kb片段和部分第一内含子的4.5 kb片段,并将1.6 kb片段插入到打靶载体p Lox的XbaⅠ/ClaⅠ位点,获得了9.6 kb的中间打靶载体p Lox5;再将4.5 kb片段插入到p Lox5的NotⅠ位点,通过酶切和PCR法验证获得了插入方向正确的打靶载体p Lox5-33。[结果]经过酶切和PCR法鉴定,最终获得了大小为14.1 kb的p Lox5-33。[结论]成功构建了绒山羊FGF5基因包含启动子区第一外显子部分序列和第一内含子部分序列的大小为14.1 kb的基因打靶载体p Lox5-33,为进一步获得基因敲除绒山羊个体以及研究绒山羊FGF5基因的功能奠定了基础。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism