微生物发酵生产α-酮戊二酸研究进展

α-酮戊二酸是微生物三羧酸循环中重要的代谢中间产物,是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点,具有广泛的应用价值.文中从4个方面归纳了国内外关于α-酮戊二酸研究进展:能够过量积累α-酮戊二酸的原核和真核微生物的发现和筛选;硫胺素缺陷型和氮源饥饿引起的α-酮戊二酸过量积累的生理学特性;控制培养环境中的pH、溶氧和辅因子对生产α-酮戊二酸发酵过程控制与优化;调控辅因子再生和代谢途径改造高产菌株.最后,讨论了微生物法生产α-酮戊二酸存在的不足和今后研究的方向.     

响应面法优化α-蒎烯发酵培养基

利用响应面法对α-蒎烯发酵培养基进行优化。先利用单因素实验法筛选出MD牛肉粉为最有利于发酵产α-蒎烯的N源。此后用Plackett-Burman(P-B)实验方法对相关影响因素效应进行评估,筛选出有显著效应的3个因素:柠檬酸用量、牛肉粉用量以及培养基初始pH。然后用最陡爬坡实验逼近以上3因素最优水平。最后由中心组和实验设计法及响应曲面分析法确定主要因素的最佳条件。在优化后的培养条件下,发现α-蒎烯产量从1.710mg/L提升到7.053 mg/L,发现产量提高了3倍左右。     

11α-羟坎利酮的高特异性生物转化合成

坎利酮是合成心血管疾病药物Eplerenone的重要中间体,其关键的C11α-羟化反应可以由微生物转化完成。本实验室保藏的根霉(Rhizopus sp.SIPI-0602)可特异性地将坎利酮转化为化合物SIPI-11。通过测定与分析SIPI-11的UV、MS和NMR图谱数据,确定化合物SIPI-11为11α-羟坎利酮。摇瓶转化工艺研究表明,底物投料浓度不高于6g/L时,11α-羟坎利酮的转化率可达到90%以上。     

α-酮酸及其盐的合成研究进展

α-酮酸及其盐是一类双官能团化合物,是重要的有机合成、药物合成及生物合成中间体,在医药和化工等行业有重要的应用前景.本文综述了α-酮酸及其盐的合成研究进展,着重介绍了近年来合成α-酮酸及其盐的几种方法.主要有羰基化法、格氏试剂法、氨基酸氧化法和海因法等,同时展望了α-酮酸及其盐的应用前景.     

响应面法优化Vc二步发酵新菌系产2-酮基-L-古龙酸的培养基

以短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)HJ-04作为维生素C二步发酵第2步中的伴生菌,促进产酸菌产维生素C(Vitamin C,Vc)前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KGA)的能力强于工业生产用菌株巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) B2980.采用单因素试验、Plackett-Burman(PB)试验及Box-Behnken试验对影响新菌系发酵产2-KGA的6个因素进行分析优化.结果表明,L-山梨糖、尿素、玉米浆为显著影响因子.最佳产酸条件为L-山梨糖94.95 g/L,尿素11.99 g/L,玉米浆14.13g/L.优化后产酸量提高12.31 mg/mL,产酸周期缩短6h.     

5-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产的工艺条件优化

葡萄糖酸氧化杆菌可将葡萄糖转化为5-酮基-D-葡萄糖酸(5-KGA),而5-KGA是重要食品添加剂L(+)-酒石酸的合成前体。为提高5-KGA产量及其对葡萄糖的转化率,对5-KGA发酵生产的工艺条件进行优化。在摇瓶水平最适的培养基和培养条件下,5-KGA最高产量为19.7 g/L,较优化前提高43.8%。在5 L发酵罐上控制恒定pH值5.5、溶氧浓度15%条件下,5-KGA产量达到46.0 g/L,较摇瓶最高产量提高1.3倍,应用葡萄糖流加工艺,5-KGA最高产量达到75.5 g/L,转化率超过70%,与已见报道的最高水平相比提高了32.0%,为实现微生物发酵生产5-KGA、进而合成L(+)-酒石酸的工业化提供了切实有效的途径。     

转化奎宁酮为(R)-3-奎宁醇菌株的筛选及转化条件优化

(R)-3-奎宁醇是一种用于合成各类药物的重要手性砌块,以奎宁酮盐酸盐为唯一碳源,筛选得到一株能够将奎宁酮不对称还原为(R)-3-奎宁醇的菌株X15。常规生理生化鉴定和18S rDNA序列分析表明,菌株X15属于粘红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa,定名为R.mucilaginosa X15。结果显示,菌株X15具有酮基还原能力和辅酶再生能力,在100 mL反应体系中可将奎宁酮还原为(R)-3-奎宁醇,转化率90%,ee值为88%。     

α-羟酸脱氢酶催化机制及其应用前景

简述α-羟酸脱氢酶家族中的乙醇酸氧化酶、乳酸单加氧酶、乳酸氧化酶、细胞色素氧化酶b2和扁桃酸脱氢酶等几种酶的蛋白质分子结构和催化机理,对该类酶的催化机制进行了比较,揭示α-羟酸脱氢酶蛋白质分子结构与功能之间的关系,为其在食品、医疗检测、重要的医药化工中间体的合成等方面的应用提供理论指导。     

2-酮基-L-古龙酸合成L-木糖的酶筛选及反应优化

[目的]构建能够以2-酮基-L-古龙酸为底物合成L-木糖的工程菌.[方法]将马来酸醋杆菌(Acetobacter malorum)、驹形氏杆菌(Komagataeibacter pomaceti、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、酸醋杆菌(Gluconacetobacter jo-hannae)中...     

利用响应面法优化α-糖苷酶抑制剂发酵培养基

【目的】采用响应面法对戈壁三素链霉菌PW409发酵合成α-糖苷酶抑制剂的培养基进行优化。【方法】采用Plackett-Burman法筛选影响α-糖苷酶抑制剂产生的关键因素,用最陡爬坡试验逼近关键因素的最大响应区域,采用Box-Behnken设计以及响应面分析法,得到各因素的最佳浓度,通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对发酵液中α-糖苷酶抑制剂进行定量分析。【结果】发酵培养基中可溶性淀粉、KNO3和K2HPO4的浓度对α-糖苷酶抑制剂的产量影响较大。优化后的培养基组成为:可溶性淀粉9.01 g/L,KNO3 11.0 g/L,K2HPO4 0.32 g/L,MgSO4.7H2O 0.50 g/L,FeSO4.7H2O 0.01 g/L,pH 7.5。【结论】在此优化条件下,链霉菌PW409发酵液对麦芽糖苷酶的半数抑制浓度IC50为22 mg/L,抑制活性较优化前提高了近10倍。发酵液中的1-脱氧野尻霉素含量可达7.84 mg/L,较优化前提高了668倍,米格列醇的含量可达0.94 mg/L,较优化前提高了10倍。     

合成酮内酯类3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B糖多孢红霉菌M的构建

大环内酯类抗生素基因工程是近年来研究的一个新领域,迄今已合成了100多种新的聚酮类化合物。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR方法扩增出去除KR6酶域DNA的约32kb DNA片段,克隆于pWHM3载体,构建了同源重组质粒pWHM2201。PEG介导原生质体转化法将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226,并整合于染色体红霉素合成基因位点。整合体在R3M斜面上生长两代后,制备原生质体涂R3M平皿。利用PCR鉴定筛选出8株KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M(1-8)。ZabsPec Fab质谱鉴定,证实糖多孢红霉菌M1合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,一种新的酮内酯类化合物。 〖HJ0     

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌种子培养基的优选

本文报道2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌种子培养基优选的结果。用生产菌株荧光假单胞菌K1005和球状节杆菌K1022进行试验,其较好的种子培养基为:葡萄糖2%,玉米浆1.0%,尿素0.2%,KH₂PO₄0.1-0.2%,MgSO₄·7H₂O 0.05%,pH7.0。廉价的玉米浆和尿素可以替代昂贵的牛肉膏、蛋白胨和酵母膏。所优选的种子培养基的原材料成本大幅度下降。     

过程优化提高解脂亚洛酵母积累α-酮戊二酸

目前,应用解脂亚洛酵母发酵生产α-酮戊二酸由于产量和底物转化率低、生产周期长等问题,仍未大规模工业化生产。为了解决这些问题,以研究室诱变选育获得的1株高产α-酮戊二酸的解脂亚洛酵母Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3为出发菌株,考察了该菌株在50 L发酵罐中转速、碳酸钙浓度、溶氧以及补料方式(多节点补料、恒速补料)等因素对α-酮戊二酸积累的影响。结果表明,当转速为300 r/min时,α-酮戊二酸和丙酮酸的产量分别为32.4 g/L和19.66 g/L;碳酸钙质量浓度为20 g/L时,α-酮戊二酸的产量提高至38.55 g/L,丙酮酸降低至8.28 g/L;控制溶氧水平在50%时,α-酮戊二酸产量为42.39 g/L,此时丙酮酸为6.22 g/L。比较高初始甘油浓度和不同的补料发酵策略,发现恒速补料效果最好,发酵144 hα-酮戊二酸产量达到66.27 g/L,丙酮酸产量为20.82 g/L。通过上述发酵过程参数的优化,α-酮戊二酸的产量和底物的转化率比未优化前分别提高了67.3%和4.56%,为解脂亚洛酵母工业化生产α-酮戊二酸提供一定参考。     

面包酵母不对称还原酮基泛解酸内酯

目的:利用市售面包酵母作催化剂,对酮基泛解酸内酯不对称还原进行了研究,并考察了底物浓度、辅因子、环糊精添加量和pH值对不对称还原反应的影响.方法:以市售面包酵母作催化剂,酮基泛解酸内酯作为底物在摇瓶中进行催化,用手性色谱柱对催化产物进行了检测.结果:发现反应条件为底物浓度低于2.56-mg/ml,辅因子选用蔗糖,β-环糊精添加量为16.7mg/ml,pH 4～5适合于酮基泛解酸内酯的不对称还原.在如上优化的催化条件下,产物得率大于45%,对映体过量率(e.e.)大于90%.结论:以酵母细胞作催化剂进行酮基泛解酸内酯不对称还原工艺具有生产光学纯泛解酸内酯的潜力.     

响应面分析法优化(R)-扁桃酸发酵培养基

采用响应面分析法对Bacillussp.HB20菌株合成(R)-扁桃酸的培养基成分进行优化。首先利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响(R)-扁桃酸产率的三个主要因素:麦芽糖、蛋白胨和牛肉膏。在此基础上用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析。结果表明,麦芽糖、蛋白胨和牛肉膏浓度与(R)-扁桃酸产率存在显著的相关性,通过求解回归方程得到最佳质量浓度:蛋白胨11.507g/L,牛肉膏6.708g/L,麦芽糖10.907g/L,(R)-扁桃酸产率理论最大值达到66.87%。经模型验证,预测值与验证试验平均值接近,在优化条件下(R)-扁桃酸产率提高了25.87%。     

代谢工程改造Gluconobacter suboxydans生产2-酮基-D-葡萄糖酸

2-酮基-D-葡萄糖酸是重要的抗氧化剂和食品添加剂——D-异抗坏血酸的重要前体。弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)具有丰富的周质空间氧化还原酶类,可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸再氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸。以提高2-酮基-D-葡萄糖酸的产量和减少副产物为目标,采用同源重组染色体修饰策略,将编码甘油脱氢酶的基因gldh置换为编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh,将编码山梨醇脱氢酶的基因sdh置换为编码2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶的基因ga-2-dh。经PCR、酶活性显色及发酵产物HPLC检测验证表明:构建的工程菌株gdh和ga-2-dh基因被强化而gldh和sdh被敲除;使用10%的葡萄糖复合培养基,摇瓶发酵72h,工程菌2KGA3发酵液中没有副产物5-酮基-葡萄糖酸,2-酮基-D-葡萄糖酸的含量终浓度达到72.3 g/L,比野生菌株提高42.2g/L,工程菌和野生菌的2-D-KGA质量转化率分别为72.3%和30.1%,工程菌比野生菌提高1.4倍。构建获得的工程菌,不需要外加抗生素,可以保持稳定遗传,对于工业化规模生产具有一定优势,为获得可产业化显示的优势遗传资源打下了基础。     

光滑球拟酵母中α-酮戊二酸脱氢酶系生理作用解析

[目的]研究α-酮戊二酸脱氢酶系在光滑球拟酵母碳代谢流、能量代谢和氨基酸代谢中的生理作用.[方法]通过敲除光滑球拟酵母中编码α-酮戊二酸脱氢酶系中E1酶的基因kgd1,构建α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失菌株T.glabrata kgd1::kan,并考察KGDH缺失引起TCA循环关键酶活性,碳代谢流量以及胞内氨基酸和能荷水平等方面的变化.[结果]光滑球拟酵母中α-酮戊二酸脱氢酶活性的缺失导致:(1)细胞启动乙醛酸途径,通过形成TCA-乙醛酸循环实现TCA循环的正常代谢;(2)胞内NADH/NAD+水平下降33.7%,ATP/ADP水平下降31.8%,而与NADH代谢相关的丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性分别提高58.1%、33.3%和32.5%;(3)胞内丙酮酸含量下降50.1%,而胞内琥珀酸、苹果酸和α-酮戊二酸含量则分别增加了172.7%、66.1%和41.1%;(4)丙酮酸族氨基酸含量下降29.3%,而胞内谷氨酸族氨基酸和天冬氨酸族氨基酸含量则提高了34.7%和26.8%.[结论]上述研究结果表明,α-酮戊二酸脱氢酶系在微生物细胞中心碳代谢、能量代谢和氨基酸代谢中发挥着重要作用.     

光滑球拟酵母中α-酮戊二酸脱氢酶系生理作用

摘要：【目的】研究α-酮戊二酸脱氢酶系在光滑球拟酵母碳代谢流、能量代谢和氨基酸代谢中的生理作用。【方法】通过敲除光滑球拟酵母中编码α-酮戊二酸脱氢酶系中E1酶的基因kgd1,构建α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失菌株T. glabrata kgd1::kan,并考察KGDH缺失引起TCA循环关键酶活性,碳代谢流量以及胞内氨基酸和能荷水平等方面的变化。【结果】光滑球拟酵母中α-酮戊二酸脱氢酶活性的缺失导致：(1)细胞启动乙醛酸途径,通过形成TCA-乙醛酸循环实现TCA循环的正常代谢;(2)胞内NADH/NAD+水平     

解脂耶氏酵母诱变育种及发酵产α-酮戊二酸条件优化

对具有发酵产α-酮戊二酸能力的解脂耶氏酵母(Yarrowia Lipolytica)ZY-4进行了紫外诱变和NTG诱变育种,筛选得到产量提高的突变株,并对突变株的发酵培养基进行了优化,结果表明,紫外诱变和NTG诱变后筛选到的突变株分别比原始出发菌株产量提高了67.8%和110%。优化后发酵培养基成分为甘油8%,氯化铵5.0 g/L,硫胺素1.0μg/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,七水硫酸镁0.5 g/L,培养基优化后α-酮戊二酸产量比原始出发菌株提高了232.4%。     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸 Ⅲ.SCB3058对2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化

棒状杆菌(Corynebactcrium sp.)突变株SCB 3058将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转化为维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸。含2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的发酵液经表面活性剂SDS处理可直接用作菌株SCB3058的转化底物。D-葡萄糖为最佳碳源,同时作为还原的氢供体。培养基中加入NH.Cl对2-酮基-L-古龙酸的生成有明显的促进作用。转化的最适pH为7.5。摇瓶发酵64小时后,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化率为50mol%。