游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成

【目的】解析Actinoplanes sp.SE50/110(简称SE50/110)中阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成机制。【方法】经过BLASTp分析,推测了Acb A、Acb B和Acb V负责阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成。首先,本研究在SE50/110中分别构建了acb A、acb B和acb V的同框缺失和回补突变株。然后,利用大肠杆菌BL21(DE3)/p Gro7分别对Acb A、Acb B和Acb V成功实现了可溶性表达。最后,以D-葡萄糖-1-磷酸为起始底物,通过体外催化反应,研究脱氧氨基糖单元的生物合成过程和相关蛋白的酶学性质。【结果】在SE50/110中分别缺失acb A、acb B和acb V基因后,相应突变株均丧失了阿卡波糖的合成能力,将acb A、acb B和acb V基因分别回补后,各菌株又恢复了阿卡波糖的合成能力,证明了它们均为阿卡波糖生物合成的必需基因。在体外酶促反应中,D-葡萄糖-1-磷酸-胸腺嘧啶转移酶Acb A催化D-葡萄糖-1-磷酸和d TTP合成d TDP-D-葡萄糖,对D-葡萄糖-1-磷酸的Km值为(0.185±0.053)mmol/L,Vmax为(2.366±0.217)μmol/(min·mg);对d TTP的Km值为(4.964±1.089)mmol/L,Vmax为(60.310±5.419)μmol/(min·mg)。d TDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶Acb B催化d TDP-D-葡萄糖转化为d TDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖,Km值和Vmax分别为(0.353±0.089)mmol/L和(306.401±28.740)μmol/(min·mg)。氨基转移酶Acb V催化d TDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖生成d TDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖,Km值和Vmax分别为(1.411±0.293)mmol/L和(3.447±0.279)μmol/(min·mg)。【结论】本研究阐明了阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成过程,为全面解析阿卡波糖生物合成途径奠定了基础。同时,测定了相关酶的动力学参数,为代谢工程改造SE50/110,提高阿卡波糖产量提供了重要的理论依据。     

阿卡波糖及其结构类似杂质生物合成与调控的研究进展

阿卡波糖是一种用于Ⅱ型糖尿病治疗的糖苷酶抑制剂,工业上采用游动放线菌Actinoplanes sp.生产.作为一种次级代谢产物,阿卡波糖生物合成复杂,游动放线菌发酵液中除阿卡波糖外还会积累大量结构类似杂质组分.由于缺乏对阿卡波糖及其杂质合成和调控机制的系统了解,难以通过调控来阻断或降低杂质合成,从而导致纯化难度大.近年...     

基因组挖掘默诺霉素生物合成基因簇的比较分析

通过对NCBI数据库的检索,使用次级代谢基因挖掘的方法对整个基因组数据进行扫描,发现含有潜在的默诺霉素家族磷酸糖脂类抗生素合成途径基因簇的6株链霉菌:Streptomyces ghanaensis、Streptomyces bambergiensis、 Streptomyces prasinus、 Streptomyces lincolnensis、 Streptomyces. sp. SAT1和Streptomyces clavuligerus。将搜寻获取的候选基因簇与S. ghanaensis中的默诺霉素合成相关基因簇进行比较基因组学分析,从共线性比对、合成基因的进化水平和同源性比对结果的分析,说明默诺霉素合成基因簇存在两种不同的进化来源与途径。其中5株链霉菌的合成基因簇位于染色体的两臂区,该区域常发生染色体插入或缺失的水平转移。通过对移动元件的基因岛序列的预测,发现默诺霉素合成基因簇是由20 kb大小的基因组岛实现了种间水平转移。基因组岛的插入是链霉菌获得新性状的重要途径,可以阐述基因簇在种间转移的途径和进化方向,以生物信息学基因组分析的角度为高产菌株的构建提供数据支持和改造。     

阿卡波糖生物合成调控蛋白的钓取与功能解析

[目的] 发现游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖生物合成的调控因子,并提高其产量。[方法] 首先,利用DNA亲和层析技术,钓取与阿卡波糖生物合成基因簇2个双向启动子区域结合的调控蛋白。然后,在阿卡波糖产生菌QQ-2中强化表达或敲除这些调控蛋白编码基因,进行体内功能验证。同时,利用大肠杆菌BL21（DE3）异源表达获得可溶性蛋白,通过凝胶阻滞实验验证蛋白与启动子区域的结合能力。[结果] 经DNA亲和层析及蛋白质质谱分析,钓取出9个与双向启动子P_WV和P_AB结合的调控蛋白。在QQ-2中分别强化表达和缺失这9个调控基因后发现,基因ACPL_1889的强化表达使阿卡波糖产量提高25%,而该基因的缺失使产量降低22%;基因ACPL_5445、ACPL_3989的强化表达使阿卡波糖产量分别降低12%和39%,而这两个基因的缺失使产量分别提高15%和8%。对阿卡波糖生物合成基因转录水平的检测发现,强化表达基因ACPL_1889使acbA、acbB、acbW、acbV的转录水平升高,而缺失该基因使这4个基因的转录水平降低;敲除基因ACPL_5445使这4个基因转录水平均有提高;强化表达基因ACPL_3989使这4个基因的转录水平均下降,而其敲除使acbW和acbA的转录水平分别提高了约100倍和40倍。在凝胶阻滞实验中,ACPL_1889与ACPL_3989均能与acb基因簇的启动子区域结合。最后将正调控基因的强化表达和负调控基因的敲除进行组合,使阿卡波糖产量提升32%。[结论] 本研究发现了9个与阿卡波糖生物合成基因簇的启动子区域结合的调控蛋白,通过体内、体外实验证明ACPL_1889为阿卡波糖生物合成的正调控因子、ACPL_5445和ACPL_3989为负调控因子,不但为揭示阿卡波糖生物合成的转录调控机制奠定了基础,而且这些调控基因的改造显著提升了阿卡波糖的产量。     

嗜热链球菌IMAU20246胞外多糖基因簇及其表达分析北大核心

【目的】嗜热链球菌IMAU20246是一株具有良好发酵特性且高产胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)的菌株,但其EPS基因簇及合成途径尚不清晰。因此可通过全基因组测序及生物信息学分析菌株基因组序列,探究EPS合成及调控机制。【方法】本实验对嗜热链球菌IMAU20246进行全基因组测序并进行生物信息学分析,解析EPS生物合成相关基因簇及EPS合成途径,同时采用实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)对其不同时间点EPS基因簇的表达进行定量分析。【结果】嗜热链球菌IMAU20246基因组中有一个18.1 kb的EPS生物合成基因簇,编码15个与EPS生物合成相关的基因。嗜热链球菌IMAU20246通过转运葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、纤维二糖及蔗糖合成UDP-葡萄糖、dTDP-葡萄糖、dTDP-鼠李糖、UDP-半乳糖、UDP-呋喃半乳糖、UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺等7种糖核苷酸。qRT-PCR的结果表明,EPS基因簇中的基因在细胞生长阶段均能表达,特别是糖基转移酶基因epsE、epsF、epsH和epsJ在培养6 h时表达量最高,此时EPS产量达到最高。【结论】本研究从基因组解析了嗜热链球菌IMAU20246 EPS基因簇及其合成途径,为菌株的进一步开发提供了理论依据。     

植物次生代谢基因簇研究进展

类似于原核生物的操纵子,在真核生物（如酵母、真菌、昆虫等）基因组中也出现了彼此功能相关的非同源基因成簇存在的现象。这些基因形成基因簇,可参与多种次生代谢途径。近年来,植物中也发现了越来越多的参与次生代谢产物合成的基因簇,它们已成为植物生物学研究的热点。本文总结并分析了植物中已鉴定的次生代谢基因簇。这些基因簇存在于玉米（Zea mays L.）、水稻（Oryza sativa L.）、拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.） Heynh.）、番茄（Solanum lycopersicum L.）等植物的基因组中,分别参与合成苯并噁唑嗪酮类、萜类和生物碱类等次生代谢产物。本文通过解析这些基因簇的组成及结构特点,对其特征进行总结,探讨了基因簇形成的分子机理及其调控机制,对植物次生代谢基因簇在合成生物学及代谢工程学中的研究方向和应用前景进行了展望。     

大肠杆菌O138 O-抗原基因簇的破译及Gne的生物信息学鉴定

利用鸟枪法对大肠杆菌E .coliO138O 抗原基因簇进行测序 ,序列全长 14 139bp ,用生物信息学的方法进行序列分析 ,共发现 11个基因 ,分别为鼠李糖合成酶基因 (rmlB ,rmlD ,rmlA ,rmlC)、UDP GalNAcA合成酶基因 (gne ,gna)、糖基转移酶基因 (3个 )、O 抗原转运酶基因 (wzx)和O 抗原聚合酶基因 (wzy)。发现一种稀有单糖UDP Gal NAcA的合成途径 ,对合成该糖的第一种酶Gne进行了生物信息学鉴定 ,另外用PCR方法筛选出了针对大肠杆菌O138的特异基因     

链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167中Naphthgeranine A生物合成基因簇的分析鉴定

【背景】微生物来源的天然产物是小分子药物或药物先导物的重要来源。对链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167的基因组分析显示,其包含多个次级代谢产物的生物合成基因簇,具有产生多种新化合物的潜力。【目的】对链霉菌S. antibioticus NRRL 8167中次级代谢产物进行研究,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物,并对相应产物的生物合成基因簇和生物合成途径进行解析。【方法】利用HPLC图谱结合特征性紫外吸收和LC-MS方法,排除S. antibioticus NRRL 8167产生的已知化合物,确定具有特殊紫外吸收的化合物作为挖掘对象,然后利用正、反相硅胶柱色谱、高效液相色谱等技术对次级代谢产物进行分离纯化,分离化合物。利用质谱及核磁共振光谱技术对化合物结构进行解析和鉴定;提取链霉菌S. antibioticus NRRL 8167基因组DNA,利用PacBio测序平台进行基因组测序;利用生物信息学对基因组进行注释,并对合成该化合物的基因簇进行定位分析,推导其生物合成途径。【结果】确定这个化合物是NaphthgeranineA,属于聚酮类化合物。全基因组序列分析发现S.antibioticusNRRL8167基因组含有28个次级代谢产物生物合成基因簇,其中基因簇20可能负责Naphthgeranine A的生物合成,并对其生物合成途径进行了推导。【结论】基于紫外吸收光谱和质谱特征,从S. antibioticus NRRL 8167菌株的发酵提取物中分离鉴定了一个聚酮类化合物Naphthgeranine A。该菌株的全基因组测序为其生物合成基因簇的鉴定提供了前提,对Naphthgeranine A生物合成基因簇和生物合成途径的推测为进一步研究这个化合物的生物合成机制奠定了基础。     

仁用杏果肉3个发育阶段的转录组分析

仁用杏果肉糖酸比低是造成其鲜食性差的主要原因。该研究以仁用杏‘山苦2号’开花后30、60和90d的果肉为材料,利用RNA-seq对仁用杏果肉进行转录组测序及差异表达基因的筛选,以了解可能与糖酸合成相关的基因及其表达模式,为进一步解析仁用杏果肉糖酸比低的分子调控模式与机制,深入研究仁用杏果肉糖酸代谢转化机制提供依据。结果显示:(1)在仁用杏果肉发育的3个阶段共获得差异表达的单基因簇(unigene)28 989条;根据单基因簇的功能注释,共发掘出19条单基因簇编码5个与仁用杏果肉中糖合成代谢相关的酶,54条单基因簇编码15个与仁用杏果肉中酸合成代谢相关的酶。(2)在所选3个发育阶段的仁用杏果肉中共发现9条与糖代谢相关的单基因簇和27条与酸代谢相关的单基因簇呈现差异表达。(3)编码与蔗糖合成积累相关的蔗糖磷酸酶和蔗糖合成酶的单基因簇主要呈下调表达,而与糖分解相关的果糖激酶和己糖激酶却呈上调表达。(4)与仁用杏果肉中主要有机酸组分苹果酸积累相关的苹果酸脱氢酶主要呈上调表达,而分解苹果酸的苹果酸酶呈下调表达。研究推测,仁用杏果肉在发育中糖积累受阻,而有机酸却得到大量的合成积累,这可能是造成仁用杏果肉糖酸比例小,鲜食口感差的主要内在因素之一。     

植物乳杆菌C88胞外多糖生物合成基因的克隆及序列比对

乳酸菌胞外多糖能显著改善发酵乳制品及食品的流变学和质构特性.为进一步了解乳酸菌胞外多糖的生物合成途径及调控机制,本研究对参与植物乳杆菌C88胞外多糖生物合成基因簇的部分序列进行了克隆和鉴定.根据GenBank中已报道植物乳杆菌基因序列的保守区域设计特异性引物,扩增出植物乳杆菌C88生物合成蛋白基因(cps4A)序列,并通过染色体步移方法克隆了植物乳杆菌C88 参与胞外多糖合成基因簇的部分序列(4.9 kb).利用生物信息学方法预测基因簇中6个阅读框的结构和功能,结果表明该序列与已报道的乳酸杆菌胞外多糖生物合成基因具有高度的同源性(>96%);对各阅读框功能预测分析发现,这6个基因主要编码参与胞外多糖合成中的多糖合成蛋白、糖链长度检测蛋白、UDP-葡萄糖-4-异构酶和糖基转移酶.本研究将为利用基因工程方法调控多糖的合成和产量提供理论依据.