siRNA对肝纤维化的抑制作用

目的：研究肝星状细胞（use）中smad2特异性小干扰RNA（siRNA）对I型胶原表达的抑制作用,探讨抗肝纤维化的基因治疗新方法。方法：设计合成靶向Smad2基因的siRNA,将筛选成功的siRNA瞬时转染入体外培养的肝星状细胞（HSC）,并给予转化生长因子p（TGF．B）刺激,应用RT—PCR和Westernblot技术检测对照组与实验组I型胶原mRNA水平和蛋白水平表达差异,研究siRNA对I型胶原表达的抑制作用。结果：siRNA能明显降低肝星状细胞中Smad2的RNA和蛋白的表达水平,证实筛选的siRNA有效,能特异性抑制Smad2的基因表达;TGF-β刺激肝星状细胞后,与对照组比较,siRNA转染组细胞外基质（ECM）成分I型胶原的表达水平明显降低（P〈0．05）。结论：siRNA能够抑制TGFβ对肝星状细胞的激活,阻断TGFB—Smads传导通路,使I型胶原分泌下调,有效抑制TGFB诱导的肝纤维化。     

促肝纤维化的关键因子——结缔组织生长因子

结缔组织生长因子（CTGF）与转化生长因子β（TGF-β）高表达于多种纤维化的组织器官中,被认为是促纤维化发生的主要细胞因子。作为TGF-β生物学作用的下游效应介质,CTGF介导TGF-β促组织纤维化的效应,而与TGF—β抗炎、调节免疫等其他生物学效应无明显相关,因此可能成为抗肝纤维化的更好的靶点。     

RNA干扰技术及其在肝纤维化中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近几年发展起来的新技术,是外源和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,因而抑制相应基因表达,导致转录后基因沉默的现象.尽管RNA干扰发现的时间较短,但由于其具有操作简单、成本低、特异性高和高效性等特点,因而发展迅速.小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的可制备使RNAi在很多领域有了应用的前景,尤其是在复杂多变的肝脏疾病中.肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是多种慢性肝病发展的共同病理基础,RNAi技术在其基因治疗领域拥有广阔的前景.RNAi具有能够调节细胞增殖、抑制致病基因的表达、影响细胞的信号转导等方面的作用,可能成为肝纤维化有效的潜在治疗手段.     

大鼠肝纤维化组织中TGF-β1的研究

目的 观察转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在大鼠肝纤维化组织中的动态表达,探讨TGF-β1在肝纤维化中的意义.方法 采用腹腔内注射二甲基亚硝胺(DMN)构建大鼠肝纤维化模型,造模后4天、1周、2周、4周、6周、8周分别检测血清ALT、AST、ALB的变化,同时取肝组织用半定量RT-PCR方法检测TGF-β1 mRNA的表达.采用HE染色及Masson三色染色,光学显微镜下观察肝组织损伤情况.采用单因素方差分析进行多组均数间的比较.结果 肝纤维化模型组血清ALT、AST明显升高,ALB明显下降.TGF-β1 mRNA在对照组大鼠和肝纤维化模型组大鼠肝组织中均有表达.与对照组相比,肝纤维化模型组4天～1周时,TGF-β1 mRNA表达差异无统计学意义(P均＞0.05).2～4周较对照组显著升高(P均＜0.05),4周时达高峰.6～8周较4周时显著下降(P均＜0.05),但仍显著高于对照组(P均＜0.05).8周较6周时下降,差异无统计学意义(P＞0.05).TGF-β1 mRNA表达与肝纤维化病程呈正相关(P＜0.01).结论 TGF-β1 mRNA在正常SD大鼠肝脏中有表达,在肝纤维化大鼠肝组织中表达增加,与大鼠肝脏病理分期正相关.     

瘦素和转化生长因子β1在大鼠肝纤维化过程中的作用

目的探讨瘦素和转化生长因子β1（transforming growthβ1,TGF-β1）在肝纤维化发生、发展过程中的作用。方法雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组和纤维化模型1周组、2周组、4周组、6周组。纤维化模型各组以CCl4造成化学性肝损伤。常规HE染色观察肝脏病变;检测血浆和肝组织瘦素及TGF-β1水平;天狼猩红胶原染色和肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量测定观察肝纤维化程度,并对肝组织瘦素水平、TGF-β1水平及肝纤维化指数（FI）进行相关性分析;赖氏法测定血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）。结果与正常对照组比较,纤维化模型各组血清和肝组织瘦素和TGF-β1水平显著升高（P〈0.05）,且纤维化模型各组肝组织瘦素水平、TGF-β1水平及FI之间两两均呈显著正相关。结论肝组织瘦素在肝纤维化发病过程中具有独立的致病作用,并可能通过激活TGF-β1通路导致肝维化的形成。     

TGF-β1/Smad信号通路在肝纤维化中的研究进展

肝纤维化是各种慢性肝病发展的终末阶段,严重威胁人类健康,肝移植是根治肝纤维化的有效方法,但其应用受到肝源短缺的限制,因此寻求肝纤维化治疗靶点、突破肝纤维化治疗具有重要意义。肝纤维化的发生过程是一个复杂的级联反应,多种致纤维因子通过相应的信号通路作用于靶细胞,使之产生致纤维化的各种生物学应答,人转化生长因子β1(Transforming Growth Factorβ1,TGF-β1)是其中最重要的致纤维化因子,Smad蛋白(Drosophila Mothers Against Decapentaplegic Protein)家族是TGF-β1信号传至核内关键的下游信号分子,TGF-β1/Smad信号通路在肝纤维化中发挥主要作用,采取不同措施阻断或调控该信号的传导可作为防治肝纤维化的重要策略,是治疗肝硬化的重要靶点,本文在总结TGF-β1/Smad信号通路在肝纤维化过程中的作用机理的基础上,综述了近年来基于此而提出的各项临床治疗策略及其研究进展。     

TGF-β1表达与乙肝患者肝纤维化的关系及临床意义

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β 1)与慢性乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝病尤其是肝纤维化发生的关系及临床意义.方法:酶联免疫吸附实验(ELISA)测定45例慢性乙肝患者(乙肝组)、39例肝硬化患者(肝硬化组)及30例健康者(对照组)血清中的TGF-β1的含量,并检测肝纤维化指标.结果:乙肝组和肝硬化组的血清TGF-β1水平高于对照组,且乙肝组血清TGF-β水平明显低于肝硬化组(P<0.05).乙肝组和肝硬化组的肝纤维化指标Ⅳ型胶原(Ⅳ-C),层黏连蛋白(LN),透明质酸(HA)的浓度均明显高于对照组,且肝硬化组肝纤维化指标均高于乙肝组(P<0.05).血清TGF-β1水平与肝纤维化指标均呈正相关(r=0.537、0.653、0.756,P<0.05).结论:TGF-β1水平与乙肝患者肝纤维密切相关,降低TGF-β1的水平,可能是防治乙肝患者后期肝纤维化的一种新方法.     

血清转化生长因子beta-1 在大鼠放射性肝纤维化中的动态表达 及其相关性研

目的:肝癌的放射治疗可导致放射性肝损伤(RILD)、甚至肝纤维化及肝硬化等并发症的发生,因此寻找较佳的血清标记物对放射性肝纤维化的无创诊断及监测具有重要意义。本文通过建立放射性肝纤维化大鼠模型,检测血清转化生长因子β1(TGF-β1)的动态表达,从而探讨其与放射性肝纤维化严重程度的相关性及其作为血清标记物的诊断价值。方法:雄性SD大鼠40只,随机分为模型组(30只)和对照组(10只)。除对照组外,模型组大鼠右半肝均接受单次6MV X线25Gy照射,于照射2月、4月、6月后,随机抽取10只,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清TGF-β1的表达,同时将大鼠肝组织进行HE染色,观察肝组织病理变化及大鼠肝纤维化程度,将后者与血清TGF-β1值进行相关性分析。结果:在照射第2月、4月、6月后,模型组大鼠血清TGF-β1值(分别为551.03±69.00 ng/L、645.31±109.29 ng/L、737.89±118.11 ng/L)逐渐升高,均明显高于对照组(451.71±51.12 ng/L,P<0.05)。通过相关性分析表明,大鼠血清TGF-β1值与肝纤维化程度正相关(r=0.82,P<0.01)。结论:在放射性肝纤维化发生发展中,TGF-β1随着肝纤维化严重程度增加,其表达亦升高。本研究为放射性肝纤维化严重程度的监测提供了一种新的无创、操作简单的手段,为后续TGF-β1作为血清标记物应用于放射性肝纤维化的临床研究奠定了理论基础。     

激动素对大鼠肝纤维化后TGF—β1和CTGF变化的影响

目的 检测激动素（kinetin）对大鼠肝纤维化后转化生长因子β1（transforming growthfactor-β1,TGF-β1）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）含量变化的影响。方法将大鼠随机分为3组,模型组,用CCl4诱导形成肝纤维化模型;激动素组,CCl4造模同时给予0．1％激动素溶液0．5ml／100g／d（每天每100克体重大鼠注射0．5ml0．1％激动素溶液）皮下注射;对照组,给予生理盐水皮下注射,治疗12周。应用免疫组化和图像分析技术对3组中TGF-β1和CTGF含量及分布特点进行观察。结果激动素组TGF-β1为（1．339±0．244）％较模型组（1．904±0．367）％显著降低（P〈0．01）,CTGF为（2．689±0．534）％较模型组（4．242±1．612）％显著降低（P〈0．01）,上述两组TGF-β1和CTGF含量较正常对照组（0．926±0．277）％和（1．608±0．644）％显著升高（P〈0．01）。结论 激动素对实验性大鼠肝纤维化具有抑制作用。     

Notch 通路在大鼠肝纤维化发生发展中作用的初探

目的:研究Notch通路在肝纤维发生发展中作用及可能的分子机制。方法:Wistar大鼠40只随机分为正常对照组与病理模型组,病理模型组皮下注射四氯化碳制备肝纤维化模型。8周后将大鼠处死,取肝组织行病理HE染色评价肝纤维化程度并采用免疫组织化学法检测Notch-1蛋白、E-cadherin蛋白与TGF-β1蛋白的表达。结果:肝组织病理HE染色示肝纤维化大鼠肝脏肝细胞坏死、再生明显,胶原纤维沉积明显增加,肝实质结构紊乱。与正常对照组相比,病理模型组notch-1与TGF-β1蛋白表达明显增加,而E-cadherin蛋白的表达明显下降(P<0.01)。结论:Notch通路在大鼠肝纤维化发生发展中可能起重要作用。     

Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA

Respiratory syncytial virus (RSV) and parainfluenza virus (PIV) are two respiratory pathogens of paramount medical significance that exert high mortality. At present, there is no reliable vaccine or antiviral drug against either virus. Using an RNA interference (RNAi) approach, we show that individual as well as joint infection by RSV and PIV can be specifically prevented and inhibited by short interfering RNAs (siRNAs), instilled intranasally in the mouse, with or without transfection reagents. The degree of protection matched the antiviral activity of the siRNA in cell culture, allowing an avenue for quick screening of an efficacious siRNA. When targeting both viruses in a joint infection, excess of one siRNA moderated the inhibitory effect of the other, suggesting competition for the RNAi machinery. Our results suggest that, if properly designed, low dosages of inhaled siRNA might offer a fast, potent and easily administrable antiviral regimen against respiratory viral diseases in humans.     

pRNA介导的RNA干扰抑制HBV表达和复制的研究

为了研究由pRNA携带的siRNA(HBVsi18-42)所介导的RNAi过程能有效地抑制HBV的基因表达和病毒复制,我们利用细胞模型和高压注射小鼠模型评价HBVsi18-42对HBV复制和基因表达的抑制作用。通过Western印迹检测细胞内的HBsAg含量,用ELISA检测细胞培养上清和小鼠血清中的HBsAg水平,采用Southern印迹检测HBV的复制中间体,通过免疫组织化学检测肝组织切片中HBcAg的表达情况。试验结果显示,HBVsi18-42能以剂量依赖的方式在293T细胞中抑制HBsAg的表达以及在HepG2细胞中下调病毒HBsAg和HBeAg的表达和病毒复制中间体的水平。在小鼠模型中,注射后的3d内HBVsi18-42使小鼠血清中HBsAg的水平分别下降了98.98%、77.07%和60.73%,免疫组织化学检测显示,在注射后的第3天小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数减少了79.1%。初步结果显示HBVsi18-42无论是在细胞或是在小鼠模型中都能下调HBV的复制和基因的表达。本研究为我们下一步实现由pRNA介导的靶向RNAi及基因治疗提供了理论和技术支持。     

pRNA介导的RNA干扰抑制HBV表达和复制的研究

为了研究由pRNA携带的siRNA(HBVsi18-42)所介导的RNAi过程能有效地抑制HBV的基因表达和病毒复制,我们利用细胞模型和高压注射小鼠模型评价HBVsi18-42对HBV复制和基因表达的抑制作用.通过Western印迹检测细胞内的HBsAg含量,用ELISA检测细胞培养上清和小鼠血清中的HBsAg水平,采用Southern印迹检测HBV的复制中间体,通过免疫组织化学检测肝组织切片中HBcAg的表达情况.试验结果显示,HBVsi18-42能以剂量依赖的方式在293T细胞中抑制HBsAg的表达以及在HepG2细胞中下调病毒HBsAg和HBeAg的表达和病毒复制中间体的水平.在小鼠模型中,注射后的3d内HBVsi18-42使小鼠血清中HBsAg的水平分别下降了98.98%、77.07%和60.73%,免疫组织化学检测显示,在注射后的第3天小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数减少了79.1%.初步结果显示HBVsi18-42无论是在细胞或是在小鼠模型中都能下调HBV的复制和基因的表达.本研究为我们下一步实现由pRNA介导的靶向RNAi及基因治疗提供了理论和技术支持.     

Efficient Inhibition of wear debris-induced inflammation by locally delivered siRNA

Aseptic loosening is the most common long-term complication of total joint replacement, which is associated with the generation of wear debris. The purpose of this study was to investigate the inhibitory effect of small interfering RNA (siRNA) targeting tumor necrosis factor-α (TNF-α) on wear debris-induced inflammation. A local delivery of lentivirus-mediated TNF-α siRNA into the modified murine air pouch, which was stimulated by polymethylmethacrylate (PMMA) particles, resulted in significant blockage of TNF-α both in mRNA and protein levels for up to 4 weeks. In addition, significant down-regulation of interleukin-1 (IL-1) and interleukin-6 (IL-6) was observed in TNF-α siRNA-treated pouches. The safety profile of gene therapy was proven by Bioluminescent assay and quantitative fluorescent flux. Histological analysis revealed less inflammatory responses (thinner pouch membrane and decreased cellular infiltration) in TNF-α siRNA-treated pouches. These findings suggest that local delivery of TNF-α siRNA might be an excellent therapeutic candidate to inhibit particle-induced inflammation.     

Prediction of Post-Operative Liver Dysfunction by Serum Markers of Liver Fibrosis in Hepatocellular Carcinoma

AimTo investigate the role of biomarkers in predicting postoperative liver dysfunction in patients with hepatocellular carcinoma (HCC).MethodsA total of 200 patients operated from July 2009 to June 2010 at Zhongshan Hospital, Fudan University for pathologically confirmed HCC were retrospectively analyzed for clinical data, HBD DNA level and serum biochemical markers for liver fibrosis. The patients were followed up to observersation end point. Correlation of the monitored parameters with postoperative liver dysfunction and patient survival was statistically analyzed.ResultsPreoperative hepatitis B virus (HBV) DNA level, serum prealbumin (PA) hyaluronic acid (HA), and laminin (LN) levels correlated with postoperative liver dysfunction. A predictive model was generated using these 4 parameters and validated in 89 HCC patients with sensitivity and specificity of 0.625 and 0.912, respectively. However, no correlation was identified between postoperative liver function and overall survival.ConclusionLiver fibrosis markers could be preoperatively used in predicting postoperative liver dysfunction in HCC patients.     

羟苯磺酸钙通过抑制Ⅰ型胶原表达减轻肾间质纤维化

目的:研究羟苯磺酸钙对小鼠肾间质纤维化、Ⅰ型胶原表达的影响。方法:将C57小鼠随机分为假手术组(Sham组,n=4)、肾间质纤维化模型组(UUO组,n=5)及羟苯磺酸钙治疗组(CDT组,n=4);采用单侧输尿管梗阻制备肾间质纤维化模型,CDT组给予羟苯磺酸钙灌胃、Sham组和UUO组给予双蒸水灌胃;采用HE染色、Masson染色、免疫组化、实时定量PCR以及蛋白免疫印迹观察单侧输尿管梗阻术后14 d小鼠术侧肾脏的肾间质纤维化程度和Ⅰ型胶原表达情况。结果:与Sham组比较,UUO组小鼠术后14 d术侧肾脏肾发生显著肾间质纤维化,Ⅰ型胶原表达显著增强(Ⅰ型胶原基因相对表达量:Sham组:1.00000,UUO组:114.92289,P0.0001)。与UUO组比较,CDT组小鼠术后14 d术侧肾间质纤维化程度显著减轻,Ⅰ型胶原表达显著减弱(Ⅰ型胶原基因相对表达量:UUO组:114.92289,CDT组:45.33516,P0.005)。结论:羟苯磺酸钙通过抑制小鼠肾间质Ⅰ型胶原表达从而减轻单侧输尿管结扎小鼠肾间质纤维化。     

家兔肝纤维化模型的建立

目的:寻找一种用四氯化碳腹腔注射建立家兔肝纤维化模型的方法。方法:用体积比为5%~27%四氯化碳溶液腹腔注射,诱导普通级别家兔形成肝纤维化。并于25天、50天、75天、100天分组处死家兔。结果:家兔肝脏纤维化程度随造模时间延长而逐渐增加。结论:长期给予四氯化碳可导致家兔的肝纤维化形成,并有较明显的阶段性变化。