丹参水杨酸结合蛋白基因的克隆、表达分析

[目的]从丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)培养细胞中克隆水杨酸结合蛋白(salicylic acid binding protein 2,SABP2)基因Sm SABP2并对其进行表达分析。[方法]用Trizol法提取丹参细胞总RNA,反转录得到c DNA,通过PCR扩增Sm SABP2,将其连接到p MD-19T simple载体中,利用酶切连接的方法构建p ET28a-Sm SABP2原核表达载体,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,检测蛋白酯酶活性。利用RT-q PCR测定水杨酸处理2 h的丹参悬浮细胞中Sm SABP2的表达量。[结果]PCR扩增获得了长度为780 bp的Sm SABP2,成功构建了原核表达载体p ET28aSm SABP2,IPTG诱导得到了Sm SABP2,SDS-PAGE电泳结果显示诱导8 h优于4 h,q PCR检测发现水杨酸处理2 h内Sm SABP2相对表达量持续升高。[结论]从丹参培养细胞中克隆了大小为780 bp的Sm SABP2,成功表达出了有活性的Sm SABP2,并且该基因能够强烈响应水杨酸诱导。     

人早胚发育相关蛋白ZNF268的抗体制备

目的:获得纯化抗原用于制备ZNF268的多克隆抗体。方法:PCR扩增目的基因片Spacer区序列,亚克隆入融合蛋白表达载体pET28a+,构建了重组质粒pET28a+/SPA。然后将该重组质粒转化E.coliDE3(Rosseta),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分离,获纯化融合蛋白6His-SPA。用6His-SPA免疫家兔,颈动脉取血,分离血清,从血清中获得ZNF268特异的多克隆抗体。结论:通过构建融合蛋白重组表达质粒pET28a+/SPA,用获得的初步纯化融合蛋白6His-SPA,制备了特异的ZNF268的多克隆抗体6His-SPA Ab。     

棉花GhDHAR2基因克隆、功能序列分析及原核表达

通过RT-PCR方法从棉花纤维组织中克隆得到脱氢抗坏血酸还原酶基因GhDHAR2的cDNA,该基因开放阅读框为639 bp,编码212个氨基酸的蛋白质。同源性序列对比分析显示,GhDHAR2蛋白具有较高的保守性,具有典型的功能结构域,包括GST-N家族和GST-C-DHAR家族的功能结构域;进化树分析显示GhDHAR2和拟南芥AtDHAR2在进化关系上较近。将GhDHAR2基因连接到原核表达载体pET-28a中,将重组载体pET28a-GhDHAR2转入到表达菌株BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达出重组GhDHAR2蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳分析显示重组蛋白大小约为28 kD,诱导表达的重组蛋白具有较高的DHAR活性。首次克隆了棉花GhDHAR2基因,通过结构域分析其可能的作用,并成功进行蛋白体外表达及酶活性分析。     

猪源戊型肝炎病毒基因IV型ORF3编码蛋白的表达及鉴定

通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF3全基因,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a（+）,构建pET28a-ORF3表达载体,转入E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达。Ni-NTA层析柱纯化表达蛋白,用SDS-PAGE、免疫印迹、ELISA等方法分析鉴定表达产物。结果成功扩增到345 bp的目的基因;构建了重组表达载体pET28a-ORF3;转化宿主菌E.coli BL21 (DE3)后表达产物的相对分子质量在6.50~16.5 kDa之间,与预期表达的目的蛋白相对分子质量相符;表达的目的蛋白能与阳性猪源和人源血清发生特异性反应,证实其具有较好的反应原性。     

香菇C_(91-3)转录本Unigene14872基因Pkinase结构域的克隆表达及其生物信息学分析

旨在克隆香菇C91-3转录本Unigene 14872基因中的Pkinase结构域,并对其进行生物信息学分析。提取香菇C91-3菌丝体中总RNA,根据转录组测序结果,用3'-Full RACE、5'-Full RACE方法获得Unigene 14872基因全长。用NCBI对其进行生物信息学分析,预测其具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Pkinase)结构域。设计引物PCR扩增Pkinase结构域,然后克隆至pET32a(+)载体,再热转化至JM109中保存并进行质粒测序。重组质粒pET32a(+)-Pkinase构建成功,并成功诱导表达重组蛋白,初步鉴定该蛋白具有抗肿瘤活性,为进一步研究重组蛋白的活性及作用机制奠定基础。     

转铁蛋白受体单链抗体与链亲和素融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:转铁蛋白受体特异性富含于血脑屏障和肿瘤细胞的表面,是当前中枢神经系统疾病和肿瘤治疗中定向转运的重要靶标。拟获得在大肠杆菌中能高效可溶表达的转铁蛋白受体单链抗体与链亲和素(SA)的重组融合蛋白。方法:根据GenBank数据库报道的SA的核苷酸序列分段合成基因,连接后经PCR获得完整的基因片段,插入pGEM-T载体中测序。将序列正确的SA基因与大鼠转铁蛋白受体单链抗体基因ox26-scFv分别插入原核表达载体pTIG-Trx中,构建重组表达克隆pTIG-Trx/scFv-SA,并在大肠杆菌中诱导表达。ELISA检测融合蛋白的生物学活性。结果:对pGEM-T/SA克隆的测序结果显示,合成的SA基因与文献报道相符。重组融合蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,约占菌体上清总蛋白量的30%;ELISA结果表明该融合蛋白具备与转铁蛋白受体和生物素的结合的双重活性。结论:有活性的重组融合蛋白的获得为构建一个通用性的以转铁蛋白受体介导的血脑屏障和肿瘤转运靶向载体打下了基础。     

苦瓜MAP30蛋白的原核表达及其生物活性研究

以天然苦瓜基因组为模板PCR扩增去前导肽后成熟的MAP30蛋白基因,克隆至可诱导表达载体pET28a中。将含MAP30基因的表达载体pET28a-MAP30转化至E. coli Rostta（DE3）中并通过IPTG诱导表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白杂交（Western blot）以及液相色谱-质谱（LC-MS）对表达的重组MAP30蛋白进行鉴定,并通过镍柱亲和层析纯化。将pUC19质粒与不同浓度的纯化后的重组MAP30蛋白孵育,分析其切割DNA的活性。同时将纯化后的重组MAP30蛋白体外作用于人乳腺癌细胞（MCF-7）,采用MTT、AO/PI双染等方法进行抗肿瘤活性分析。实验结果表明纯化后的蛋白经质谱鉴定和Western blot分析,目的蛋白成功地与His-tag融合表达。首次发现大肠杆菌异源表达的重组MAP30蛋白同天然蛋白一样可以切割超螺旋DNA活性。MTT、AO/PI双染结果证实重组MAP30体外可诱导MCF-7细胞发生凋亡。通过基因工程技术大量制备MAP30蛋白,进一步研究其体外生物学活性,为以后的临床应用奠定基础。     

Lys_(10)-PAI-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和凝胶阻滞实验

用PCR方法构建 10个赖氨酸与纤溶酶原激活剂抑制物 1的融合基因Lys10 PAI 1,并克隆于pET2 8a(+ )和pET32a(+ )原核表达载体 .将重组表达质粒pET32 PAI和pET2 8 PAI转化大肠杆菌BL2 1(DE3) .IPTG诱导后可获得分子量分别为 6 3kD和 4 3kD的目的蛋白 ,表达蛋白占菌体蛋白2 0 %以上 ,大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物经变性、复性、超滤、透析和亲和层析等步骤 ,可以得到纯化的Trx·PAI 1和rPAI 1重组蛋白 .Western印迹结果表明 ,目的蛋白具有人PAI 1的抗原性 .凝胶阻滞实验发现 ,纯化的重组蛋白在一定条件下 ,可以与质粒结合 ,使质粒的迁移率明显改变 .研究结果表明 ,Trx·PAI 1和rPAI 1有希望成为受体介导基因转移的配体     

凝血靶向通用效应因子tTF/SA融合蛋白的表达及活性鉴定

制备凝血靶向通用效应因子tTF/SA融合蛋白,并鉴定其生物学活性。利用PCR技术构建tTF与链霉亲和素SA的融合基因,克隆至表达载体pET22b( ),在E.coliBL21(DE_3)中表达,镍亲和层析柱纯化tTF/SA融合蛋白。凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白中tTF的活性,ELISA鉴定融合蛋白中SA与生物素Biotin结合的活性。获得序列正确的tTF/SA/pET22b( )重组子,融合基因在E.coliBL21(DE_3)中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化FⅩ、引起血液凝固的能力,且能与生物素结合。融合基因已成功在E.coliBL21(DE_3)中表达,tTF/SA融合蛋白具有TF和SA活性。融合蛋白tTF/SA可作为通用效应因子,与生物素化的肿瘤组织血管特异性载体联用,实现选择性诱发肿瘤组织血管栓塞的多点治疗。     

猪链球菌2型溶血素基因与38KDa蛋白基因克隆及联合表达

目的:研究有效的猪链球菌病疫苗。方法:以四川株猪链球菌2型基因组DNA为模板分别扩增溶血素基因和38KDa基因主要功能区基因;并经连接、克隆及酶切鉴定。分别构建原核表达载体pET32a-Sly、pET32a-38KDa,提取阳性克隆质粒分别进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片断,将目的片断定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为60Ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western-blotting)证实该重组蛋白可以与SS2阳性血清发生特异性反应。结论:本研究为重组蛋白的免疫保护应用奠定基础。     

拟南芥AtNHX2启动子的克隆及表达模式分析

AtNHX2基因是拟南芥NHX基因家族的一员,编码了一种液泡膜中的Na+/H+反向运输体并对拟南芥的耐盐能力起着重要的作用.采用PCR扩增的方法克隆了拟南芥AtNHX2基因启始密码子上游约2.8kb的DNA片段,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301-1中,通过基因枪轰击洋葱表皮瞬时表达的方法,初步检测启动子的活性.将重组质粒pCAMBIA1301-1/AtNHX2 promoter转化拟南芥并筛选纯合子.AtNHX2 promoter-GUS分析显示AtNHX2在所有的组织中均有表达,包括根尖.在保卫细胞中检测到了强烈的GUS表达,这一结果表明,AtNHX2对特殊细胞的pH调控和K+自身稳定方面起着重要的作用.AtNHX2启动子的活性可被NaCl抑制,并且抑制的强度和NaCl的浓度成正相关.300 mmol/L KCl处理可增强启动子的活性,说明NaCl和KCl是在转录水平上调控AtNHX2的表达.在老叶中GUS活性比在新叶中GUS活性强,这说明了AtNHX2优先将有毒的离子积累在老叶中,从而有利于植物的正常发育.在根毛细胞中也观测到了强烈的GUS活性,这就暗示了AtNHX2在扩大的液泡中储存Na+.     

甘蓝型油菜BnCOP1基因编码区全长cDNA的克隆与功能研究

通过分析拟南芥、豌豆、番茄和水稻的COP1 (constitutively photomorphogenic 1) 的cDNA序列, 运用RT-PCR和改进的基因组步行 (genome walking) 技术相结合的方法, 首次从甘蓝型油菜中克隆到油菜 BnCOP1编码区cDNA的全长序列, 其全长2 034 bp, 编码677个氨基酸. 同源 性分析表明, 其编码的氨基酸序列与拟南芥的同源性高达94%. 对BnCOP1编 码序列（cDNA）演绎出的氨基酸序列分析表明, 其编码的蛋白包含有N端的 环形锌指结合域(ring finger zinc binding domain, RING)、中间的卷曲 螺旋形结构域(coiled-coil domain, coiled-coil ), 7个C端的WD-40重复 序列(WD-40 repeats, WD-40)的功能域. 半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR 分析该基因在油菜中的表达模式,结果显示, BnCOP1在甘蓝型油菜的各个组 织器官中均有表达,其中在花中的表达明显高于在根、叶、茎、果荚及子叶 和胚轴中,暗示该蛋白可能与开花途径相关. 过表达BnCOP1的转基因拟南芥 植株在高度、主茎的直径和叶片大小上都呈现出比野生型弱小的表型, 表 明BnCOP1抑制了拟南芥光形态建成从而影响了植物的生长发育.     

转拟南芥AtKup1基因高含钾量烟草获得

提取拟南芥幼根总RNA,进行RTPCR逆转录,产物测序,将其构建到含Km(带内含子)筛选标记的植物双元表达载体上,根癌农杆菌介导法将AtKup1基因导入烟草,对转化子进行PCR扩增、GUS染色、Southern杂交和AtKup1基因mRNA荧光定量PCR分析,并进行烟叶内在成分化验分析。PCR获得2100bp左右扩增产物,测序结果证实扩增产物序列与拟南芥AtKup1基因(GenbankNo:AF029876)一致;得到GUS染色阳性的AtKup1基因转化烟草材料29株。经PCR扩增、分子杂交检测证实AtKup1基因已整合到转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析可以在幼根中检测到AtKup1基因的mRNA转录。烟叶含钾量化验结果表明导入的AtKup1基因在转化材料中成功表达,使烟叶含钾量提高约45%。     

Functional characterization of pathogen-responsive protein AtDabb1 with an antifungal activity from Arabidopsis thaliana

A plant antifungal protein was purified from Arabidopsis thaliana leaves by using a typical procedure consisting of anion exchange chromatography and high-performance liquid chromatography. We determined the amino acid sequence of the purified protein using MALDI-TOF/MS analysis, and found that the sequence matched that of a hypothetical Arabidopsis protein in GenBank (accession number NP_175547). We designated the protein as AtDabb1. After the cDNA encoding the AtDabb1 gene was cloned from an Arabidopsis leaf cDNA library, the recombinant protein was expressed in Escherichia coli and found to significantly inhibit cell growth of various pathogenic fungal strains. mRNA expression of the AtDabb1 gene was induced by pathogen-related signaling molecules including salicylic acid and jasmonic acid. These results suggest that AtDabb1 may contribute to the induced plant defense mechanism against diverse pathogenic fungi.     

灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因（CgVP1）过表达提高拟南芥的耐盐性。

克隆获得包含完整开放阅读框（0RF）的灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因（CgVP1）cDNA序列,构建成基因表达载体pCAMBIA1301．1-CgVPl后,利用根癌农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,再以抗性筛选方法获得了T3代纯合的转基因植株,经检测外源目的基因已经整合到拟南芥基因组中并能正常表达。分析结果表明,在拟南芥中过表达劬VP1基因后提高了植株抗盐胁迫的能力。     

干旱诱导性启动子驱动的海藻糖－6－磷酸合酶基因载体的构建及转基因烟草的耐旱性

The trehalose-6-phosphate synthase gene (TPS) from Saccharomyces cerevisiae Hansen and the drought-responsive promoter from Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. have been cloned by PCR procedure. A plant expression vector with TPS under control of Prd29A has been constructed and used for the genetic transformation of tobacco. The transgenic tobacco with Prd29A/TSP demonstrated TPS expression with increased drought tolerance under drought stress. Some obvious morphological changes including dwarf and fine shoot, lancet-shaped leaves and vigorous auxiliary buds have been observed in a few transformed plants.     

转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体

目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用Gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据Gateway克隆技术的要求,设计含有attB接头的引物,利用高保真的PlatinumpfxDNA聚合酶,通过PCR方法在克隆基因的两端加上B序列。通过BP反应将包含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP的donor载体上以产生Entry克隆,通过LR反应将已经重组入Entry载体的DREB1A基因再克隆到pH2GW7双元载体。结果:对重组载体pH2GW7-DREB1A的鉴定结果表明成功构建了DREB1A基因的植物表达载体。结论:利用Gateway克隆技术构建植物表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究奠定了基础。