重组人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor Kazal结构域的原核表达、纯化及活性鉴定

Hespintor是应用抑制消减杂交技术 (SSH) 从肝母细胞瘤细胞系HepG2中筛选得到的一未知功能蛋白,序列分析表明该蛋白属于Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子 (Serine proteinase inhibitor, Serpin) 家族中的一个分泌型新成员,具有与食管癌相关基因2 (Esophageal cancer related gene 2, ECRG2) 高度同源的Serpin基本结构。为了进一步阐明Hespintor的生物学功能,必须得到纯化的Hespintor蛋白。先将Hespintor Kazal结构域编码序列亚克隆至原核表达载体pET-40b(+),转化至Rosetta (DE3) 表达宿主菌中。经 0.25 mmol/L IPTG,30 ℃诱导5 h获得了分子量约为42 kDa的Hespintor-Kazal重组融合蛋白的优化表达,Western blotting证实了重组蛋白的特异性。Hespintor-Kazal重组融合蛋白以包涵体形式在宿主菌中表达,利用金属螯合亲和层析和阴离子交换层析柱对重组蛋白进行两步纯化。初步的活性鉴定表明,纯化的Hespintor-Kazal重组融合蛋白能特异性抑制胰蛋白酶的水解活性,提示Hespintor具有作为一种新型抗肿瘤药物的潜在开发价值。     

人Pokemon蛋白锌指结构域的表达与纯化

旨在原核表达Pokemon基因的锌指结构域,纯化获得GST-Zinc finger的融合蛋白。以人胶质瘤T98G细胞的c DNA为模板,利用PCR扩增带有Bam H I和Sal I酶切位点的人Pokemon基因的锌指结构域,然后将其克隆到p GEX-4T-1原核表达载体中。将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,再利用Magne GST particles亲和纯化Zinc finger融合蛋白,最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。结果显示,成功构建p GEX-4T-1-Zinc finger原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Zinc finger蛋白;经Magne GST particles纯化的GST-Zinc finger蛋白可被识别Pokemon锌指结构域的抗体特异识别。纯化的GST-Zinc finger蛋白可用于后续的生物学研究。     

重组人ASCT2的C-末端胞外结构域的原核表达、纯化及鉴定

中性氨基酸转运蛋白（ASCT2）是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,其最大的胞外结构域存在于C-末端的105个氨基酸（以下简称TAIL）。通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的TAIL序列,与pET-41b（克隆位点的N-和C-端分别有谷胱甘肽转移酶和His6标签序列）连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得表达,免疫印迹显示重组蛋白TAIL在细菌裂解液上清和沉淀（包涵体）中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的TAIL蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,提示其可能具有结合合胞素的活性。     

人膜联蛋白V在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的：构建人膜联蛋白V的原核栽体并诱导其表达。方法：以IPTG诱导His融合人膜联蛋白V的表达,并应用Ni—NTA Superflow纯化。结果：PCR扩增产物碱基数量与目的片段大小一致,插入片段的序列与发表的人膜联蛋白V基因编码序列一致。在IPTG诱导下,重组大肠杆茵DH5a高效表达分子量约36kDa的目的产物。结论：人膜联蛋白V编码序列已被克隆至His融合表达载体pET-28a（＋）上,并在大肠杆菌DH5α中表达：     

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4的IgC2结构域蛋白的原核表达和纯化

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4基因是新克隆的脑瘤相关基因,采用多聚酶链式反应（PCR）方法获得长约500bp含IgC2结构域的DNA序列,扩增产物克隆至pGEX-4T-2质粒中,构建GST融合表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,经包涵体沉淀,溶解,Glutathione-Sepharose亲和层析纯化获得融合蛋白,并以Western blot鉴定证实,通过IgC2结构域蛋白的纯化分离该结构域,为进一步研究该结构域及LRRC4基因的结构和功能奠定了基础。     

人胱硫醚β-合酶及其截短型片段的表达、纯化和活性测定

将人胱硫醚β-合酶(CBS)基因克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得的重组质粒pGEX-4T-1-CBS转入大肠杆菌E.coli Rosetta (DE3)菌株,构建了高效表达CBS的重组菌E.coli Rosetta (pGEX4T-1-CBS)。重组菌在0.1mmol/L的IPTG于30℃诱导16h,可溶性CBS表达量达到28mg/L培养基。将重组菌破碎后上清液经GSTrap Fast Flow亲和层析一步纯化得到CBS融合蛋白,在凝血酶柱上切割缓冲液中加入3%甘油和0.1%CHAPS可以有效抑制酶切后CBS聚沉,酶活性回收率为54.8%,蛋白质产率为15.2mg/L培养基,纯度达到95%,单位酶活为143U/mg,终浓度为1mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)可使CBS单位酶活提高5.1倍,达到735U/mg。同时构建了表达CBS_1-413(删除了CBS羧基端调控域138个氨基酸残基)的重组菌E.coli Rosetta (pETDuet-1-CBS_1-413),经过一步HisTrap Fast Flow亲和层析,酶活性回收率为74.3%,蛋白质产率为12.8mg/L培养基,纯度达到95%,单位酶活为965U/mg; 还表达和纯化了胱硫醚β-裂解酶(CBL),并在此基础上建立了一种新的CBL偶联的CBS酶活性测定方法。     

β2肾上腺素受体基因在毕赤酵母中的表达及活性测定

为提高β2－肾上腺素受体(β2AR)表达量,满足生产需求,使其应用到抗体技术上,利用分子克隆技术将β2－肾上腺素受体基因(β2AR)与绿色荧光蛋白基因(eGFP)克隆到毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体中。表达载体pPICZαDNAsGFP转化至酵母后,β2AR和eGFP基因与酵母基因重组。利用筛选出的阳性重组子诱导表达β2AR和eGFP的融合蛋白,通过125I标记的配体结合实验证明获得了有受体活性的融合蛋白。     

猪瘟病毒E2蛋白A3BCD主要抗原结构域的原核表达

目的：对猪瘟病毒E2蛋白A3BCD进行原核表达,以期获得具有抗原活性的表达产物。方法：利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nPCR）技术从河南省近期流行猪瘟病毒野毒株中扩增得到E2基因,并将其克隆至pUCm-T载体,构建克隆载体pUCm-TE2;利用PCR方法扩增E2基因的主要抗原域A3BCD,克隆至pET-32a（＋）载体,构建表达载体pET-32aE2-2,转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）中,用IPTG进行诱导表达,对诱导产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果：SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约35000处出现预期条带,表达产物主要以包涵体形式存在;Western-blotting检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带;用8mol／L尿素（pH8.0）溶解包涵体,经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得纯度较高的目的蛋白,ELISA检测表明能与猪瘟抗体阳性血清发生特异性反应。结论：重组质粒pET-32aE2-2转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,解除了由于稀有密码子造成的表达限制,表达量得到提高;表达产物为硫氧还蛋白和E2-2的融合蛋白,易于纯化,且具有活性,为研制猪瘟抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础。     

酪氨酸激酶EphB2受体N端球状结构域的表达及纯化

根据酪氨酸激酶ＥｐｈＢ２受体的碱基序列,用ＰＣＲ方法扩增其结合配体的关键结构域Ｎ端球状区,定向克隆到融合表达质粒载体ｒＲＳＥＴ Ａ中,转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）。阳性克隆经ＩＰＴＧ诱导,由Ｔ７启动子调控表达了氨基端带６个连续组氨酸残基的融合蛋白。电泳分析表明,表达的融合蛋白主要以包含体的形式存在,约占细菌总蛋白的１４％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹确证,利用Ｎｉ－ＮＴＡ金属螯合亲和色谱法在变性条件下对     

人ppGalNAc-T2的原核表达、纯化及其蓖麻蛋白样结构域的结构预测

多肽∶N乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)是催化O糖基化的起始酶,在O聚糖的形成中起着关键的作用.为更好地研究该家族酶的结构与功能,采用PCR技术从pDONR201T2得到ppGalNAcT2全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pGEX4T1,转化大肠杆菌BL21,获得相应表达产物,用谷胱甘肽S转移酶(GST)亲和层析柱进行纯化,并进行了Western印迹检测和初步的酶活测定.为进一步研究其功能还在结构研究上利用网络结构模拟SWISSMODEL服务器对ppGalNAcT2的蓖麻蛋白样结构域进行结构模拟.成功构建了原核表达载体pGEX4T1T2,获得有效表达和纯化,并初步鉴定了其活性,同时预测了其可能的三维结构和活性位点.     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化

[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。     

重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2 α亚基     

盘状结构域受体2胞外区的可溶性表达、纯化和功能鉴定

盘状结构域受体2（discoidin domain receptor 2,DDR2）是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酷氨酸激酶,其配体为纤维性胶原,胶原对DDR2的活化上调细胞中基质金属蛋白酶1（MMP－1）的表达。为研究DDR2在类风温性关节炎(rteumatoid arthritis,RA）软骨破坏和肿瘤转移中的作用,尝试了在大肠杆菌中表达一段DDR2胞外区（命名DB）,并进行了可溶性部分的纯化和功能鉴定,以备将来用作DDR2的特异性阻断剂。获得了一株表达GST－DB融合蛋白的大肠杆菌克隆;其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的13％;经GST融合蛋白特异性亲和珠纯化后,获得了纯度约86.1%的可溶性GST－DB融合蛋白;竞争结合抑制实验显示,GST－DB具有阻断Ⅱ型胶原和细胞表面天然DDR2受体结合的功能;细胞实验表明,GST－DB有抑制Ⅱ型胶原刺激下的类风湿性关节炎滑膜细胞和NIH3T3细胞分泌MMP－1的作用。以上结果提示,表达的融保蛋白GST－DB具有抑制天然DDR2功能的作用;DDR2在滑膜细胞和NIH3T3细胞中介导Ⅱ型胶原刺激下的MMP－1的分泌。     

重组人ASCT2胞外结构域ECL2在大肠杆菌中的表达及其鉴定

中性氨基酸转运蛋白(ASCT2)是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,ECL2是该受体的其中一个较大的胞外结构域.通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的胞外区ECL2序列,与pET-41b连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白在N-和C-端分别融合谷胱甘肽转移酶(GST)和His6标签,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的重组蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,具有结合合胞素的潜在活性,这些结果为进一步研究ASCT2与合胞素的相互作用奠定了基础.     

重组人CK2β亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的重组质粒, 转化大肠杆菌BL21 (DE3), 在IPTG诱导下表达. 表达蛋白大多数以不溶形式存在. 6L(约10.2 g)表达菌抽提得到约20 mg的可溶性表达产物, 通过P11磷酸纤维素一步层析分离, 得到6.8 mg纯化蛋白. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化的蛋白为一分子质量26 ku的单一蛋白带.蛋白质印迹结果证明：纯化的表达产物与抗人CK2β抗体可发生特异性免疫反应. CK2β亚基对CK2α有激活作用, 纯化的CK2α和β亚基在等摩尔混合时即可组成有最大生物活性的全酶. 实验结果有力地证明了克隆表达与纯化的重组蛋白是人蛋白激酶CK2β亚基.     

重组内肽酶AspN的原核表达纯化和活性鉴定

蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶,能选择性切割天冬氨酸的N端肽键,广泛应用于蛋白的多肽制备及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN来源于细菌分泌,产量低,制备困难,成本高,极大地限制了该酶的应用。将脑膜脓毒性黄杆菌分泌的蛋白内肽酶Asp N所对应的基因克隆入表达载体p ET32a,导入E.coli BL21(DE3),首次运用原核表达系统进行可溶性融合表达,亲和层析对重组蛋白进行纯化。用HPLC、SDS-PAGE和荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe(NO2)-Tyr-Asp对重组酶进行酶活鉴定。结果表明重组的内肽酶Asp N具有与标准品基本一致的酶切活性,能够较好地应用于生物和制药领域。     

人EGF受体L2结构域在大肠杆菌中表达、包涵体柱上复性及纯化

以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码EGFR-L2结构域的DNA片段,在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET-3c连接构建EGFR-L2原核表达载体。该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,免疫印迹分析表明表达产物全部以包涵体形式存在,分步透析法和稀释法都不能获得可溶性复性产物,而Ni²⁺-NTA柱上复性法不仅能够获得可溶性的EGFR-L2蛋白,而且产物同时得到高度纯化,纯度>95％,复性的EGFR-L2与其配基EGF具有特异性的结合活性,但亲和力较低。这表明His6标签不但便于纯化目标蛋白,而且可利用Ni²⁺-NTA柱进行柱上复性,适用于不易通过常规方法复性的重组蛋白的制备。     

干扰素-tau的原核表达、纯化和活性测定

干扰素-tau (IFN-tau)是一种新发现的I型干扰素,为了更清楚的研究它的生物学功能,在已克隆IFN-tau cDNA的基础上,PCR扩增出IFN-tau ORF,与原核表达载体pBV220重组后,成功的构建了IFN-tau的原核表达质粒pBV220/IFN-tau。重组质粒转化大肠杆菌BL21,该菌经过诱导,用凝胶过滤色谱层析的方法获得了纯化的目的蛋白,该蛋白经过氨基酸序列分析证实是IFN-tau ;用细胞病变抑制法测定IFN-tau经过透析复性后的活性为2.09×106IU/ml,比活性为2.35×106IU/mg。     

UHRF2结构域突变体的原核表达与纯化

目的构建UHRF2各个以结构域为基础的突变体原核表达载体,在大肠埃希菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定。方法以pCMV-3xFlag—UHRF2为模板,PCR扩增UHRF2的各个结构域基因片段,各PCR产物经酶切后连接到pGEX-4T-1载体上;将重组载体转化大肠埃希菌（BL21菌株）,IPTG诱导表达各GST融合蛋白,超声波破碎细菌,离心收获蛋白并经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（glutathione sepharose 4B）亲合纯化;纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色或免疫印记实验鉴定各蛋白表达情况。结果成功构建了UHRF2结构域突变体的原核表达载体,各突变体蛋白表达正确。结论UHRF2各结构域突变体的成功构建便于用GST pull—down实验研究UHRF2参与与其它蛋白相互作用的结构域,为了解UHRF2功能打下了基础。