MMP-9-PEX原核表达、纯化及其对结肠癌细胞侵袭能力的影响

用RT-PCR法扩增出基质金属蛋白酶-9(MMP-9)C末端血红素结合蛋白样结构域(PEX),克隆至表达载体pET32a中并转化至E.coilBL21(DE3),经IPTG诱导后在约为42kDa处发现有外源基因的表达,密度扫描显示表达蛋白含量占菌体总蛋白的50%左右。重组蛋白质pET32a/PEX主要以包涵体形式表达,其在上清液中的含量极微。含8mol/L尿素和10mmol/LDTT的裂解缓冲液溶解的包涵体采用金属整合层析有效分离出目标蛋白,纯化后pET32a/PEX蛋白质的纯度大于90%。在Transwell实验中发现复性纯化后的重组蛋白质pET32a/PEX能抑制结肠癌细胞的侵袭,且呈剂量依赖性。     

特异识别HIV-1序列的锌指蛋白的表达纯化及其在Biacore CM-5芯片上的固定

目的:为了更好地利用Biacore 3000研究锌指与核酸的相互作用,将特异性识别HIV-15′端一段保守序列的三锌指蛋白固定在CM-5芯片上。方法:将特异性识别HIV-15′端一段保守序列5′-CTGTGTTTG-3′的三锌指基因克隆到表达载体pET-22b( )中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组三锌指蛋白,超声碎菌进行SDS-PAGE分析;包涵体形式的表达产物用盐酸胍溶解后,经一步凝胶柱复性并纯化;随后摸索适宜固定的pH值并通过化学方法进行固定。结果:表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化及柱复性后的蛋白纯度为98.8%,并在CM-5芯片上成功固定。结论:本研究为利用Biacore实时定量研究锌指蛋白与其识别DNA的相互作用进行了尝试。     

包涵体蛋白体外复性的研究进展

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时 ,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白 ,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠 ,才能够得到生物活性蛋白。近年来 ,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集 ,提高活性蛋白的产率。     

gAd重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了建立人脂联素球状结构域(gAd)原核高效表达体系,分离纯化gAd并检测其生物活性,从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,通过T-A克隆的方法克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物引入起始密码、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导目的蛋白的表达;超声破菌,分离纯化包涵体,8mol/L尿素溶解,采用梯度稀释法复性重组蛋白,动物实验测定其活性。结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定的以包涵体形式的高效表达,表达量约占全菌蛋白的20%,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分离得到的包涵体具有较高纯度,复性后具有降低家兔血糖和游离脂肪酸的作用。为进一步研究gAd的生物学活性、作用机制奠定了基础。     

鼠源休眠蛋白具有抑制内皮细胞增殖和诱导细胞凋亡的活性

内皮抑素 (endostatin)是最近发现的一种具有抑制血管生长的蛋白质。休眠蛋白 (restin)是内皮抑素的同源蛋白质 ,最早由Ramchandran等人发现 ,它来源于胶原蛋白XV的羧端非胶原蛋白结构域 (NC1)。为了研究鼠源休眠蛋白对内皮细胞生长的影响 ,利用RT PCR从鼠肌肉中扩增出它的基因 ,克隆入原核表达载体pQE32。诱导后 ,重组蛋白质以包涵体形式高效表达 ,表达量约占菌体总蛋白质的 6 0 %～ 70 %。重组蛋白质经纯化复性后 ,可以特异地抑制bFGF刺激的牛主动脉内皮细胞的增殖 ,但是休眠蛋白的抑制活性比内皮抑素活性稍低。流式细胞仪检测发现 ,休眠蛋白可以引起内皮细胞的细胞周期的改变 ,并且引起细胞凋亡     

一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法

利用8 mol/L尿素溶液对表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白进行变性,通过逐级稀释复性的方法对尿素溶解后的GST-TRAF6融合蛋白进行复性,将复性后的GST-TRAF6融合蛋白进一步利用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析的方法进行分离纯化,将分离纯化后的蛋白通过Western blot方法进行验证,最后利用体外泛素化反应检测经包涵体变性、复性和纯化后的GST-TRAF6融合蛋白的生物学活性。经过包涵体变性、梯度稀释复性和谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析3个步骤后纯化得到纯度达90%以上、浓度为396 ng/μL的蛋白质溶液。利用GST蛋白作为对照,经Western blot验证表明,纯化得到的蛋白确为GSTTRAF6融合蛋白。进一步利用体外泛素化反应分析其泛素连接酶活性发现,17 ng/μL浓度的GST-TRAF6融合蛋白能够以泛素分子作为底物在5 min内快速催化自由泛素链的生成。结果表明,表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白经尿素变性溶解后能够成功复性并分离纯化,在溶解性改变的同时恢复了其泛素连接酶活性。为从大肠杆菌包涵体中大规模分离纯化蛋白质提供了一种新的复性方法。     

抑菌蛋白Reg3A的表达纯化与功能

利用原核表达系统表达人源抑菌蛋白Reg3A,经包涵体的复性和纯化获得有体外抑菌功能的活性抑菌蛋白,并对其体外抑菌功能进行初步研究。构建Reg3A原核表达载体PET-32a-Reg3A转化补充稀缺tRNA基因的表达菌株大肠杆菌BL21-Codonplus,阳性重组子采用诱导培养基诱导5h后,采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白,经包涵体蛋白的纯化和透析复性后通过Ni-NTA亲和层析交换柱,获得纯度达95%的蛋白质。Western blot鉴定显示在15 kD处有特异性条带。使用纯化后的蛋白进一步进行抑菌圈实验和抑菌活性实验,对获得蛋白的体外抑菌活性进行评估,从而为进一步进行Reg3A蛋白功能的评估及应用奠定基础。     

人血小板衍生生长因子BB亚型包涵体复性与纯化

目的:优化人血小板衍生生长因子BB亚型(PGDF-BB)包涵体复性方法与纯化条件,获得具有较好生物活性的重组PGDF-BB蛋白。方法:对PGDF-BB包涵体以梯度尿素进行变性,选择最佳包涵体变性浓度;比较不同复性条件下的复性率,稳定PGDF-BB包涵体复性方法;参照该蛋白的理化性质,选择适合PGDF-BB重组蛋白的纯化方法。结果:原核系统内实现了PGDF-BB的高表达;通过优化包涵体复性方法,重组蛋白的包涵体复性率可达40%以上;经过多个纯化方法相结合,PGDF-BB的纯度达到95%。结论:通过实验条件的优化,提高了PGDF-BB包涵体复性率,获得高纯度、高生物活性的重组PGDF-BB蛋白。     

RGD-葡激酶的凝胶过滤层析法复性及其纯化

构建的溶栓和抗栓双重功能的RGD-葡激酶突变体(RGD-Sak)在大肠杆菌中高表达,目的蛋白质以包涵体形式存在。为获得有活性的蛋白质,需要对包涵体进行变复性。利用凝胶层析方法对包涵体中RGD-Sak进行复性,并与稀释复性法进行比较,发现凝胶柱复性方法具有操作周期短、简便、成本低而高效等优点。复性后蛋白质用Q-Sepharose FF离子交换进一步纯化,纯度达95%,酪蛋白凝胶板活性测定表明两种复性法得到的蛋白质比活性相当。圆二色谱测定显示两种复性法得到的蛋白质的二级结构成份和谱形一致,说明在两种复性过程中完成了RGD-Sak分子的正确折叠。     

猪尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

本研究报道了猪尿酸氧化酶(Porcine urate oxidase,pUOX)的原核表达载体的构建、pUOX的蛋白表达条件的优化以及对pUOX经纯化后进行活性检测和酶学性质分析。利用RT-PCR从猪肝总RNA中克隆pUOX,定向插入原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET30a(+)/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。重组质粒pET30a(+)/pUOX经双酶切鉴定和序列分析,证实已成功构建了重组表达载体。重组表达菌经IPTG诱导表达了约为41kD的蛋白,与预期分子量一致,并对pUOX蛋白表达条件进行了优化,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞中,包涵体经过变性、复性后,用Ni2+-NTA对复性蛋白进行亲和纯化,并对纯化蛋白进行了活性检测和酶学性质分析,纯化的重组pUOX的比活为50.63IU/mg,并发现重组蛋白在最佳温度、热稳定性等方面与天然pUOX相同,为后续动物实验奠定重要的基础。     

Overexpression and purification of single zinc finger peptides of human zinc finger protein ZNF191

ZNF191, a new human zinc finger protein, probably relates to some hereditary diseases and cancers. To obtain structural information of zinc finger domain a convenient method for obtaining milligram quantities of each zinc finger peptide of ZNF191 is necessary. Here, we report an Escherichia coli expression system for rapid and high-level expression of zinc finger 3 and zinc finger 4 of ZNF191. The gene of zinc finger 3 or zinc finger 4 was cloned into pET31b vector to allow expression of single zinc finger peptide as a ketosteroid isomerase (KSI) fusion protein. The KSI-single zinc finger fusion protein was overexpressed in the form of inclusion body, which can be purified by washing several times using buffer solutions, and then be cleaved directly by cyanogen bromide to release single zinc finger peptide. The more than 20mg/L yield of single zinc finger peptide was achieved with more than 95% purity by using YM ultrafiltration membranes. Circular dichroism spectra of these two single zinc finger peptides titrated with Zn(2+) ions demonstrate that they have different secondary structures.     

PLZF与哺乳动物雄性生殖干细胞的发育分化

早幼粒细胞白血病锌指蛋白（promyelocytic leukemia zinc finger,PLZF）,也被称为ZBTB16(zinc finger and BTB domain containing 16,ZBTB16)或锌指蛋白145(zinc finger protein 145,ZFP145),是我国学者发现与人类疾病相关的蛋白质.人类PLZF的是由673个氨基酸残基组成的转录抑制因子,属于蛋白质超家族. 该超家族以N端的BTB/POZ（bric-à-brac, tramtrack, brad complex(BTB)/poxvirus zinc finger (POZ) domain）结构为特征. PLZF蛋白的BTB/POZ结构与个体发育、胚胎发生、染色体的重构等事件相关.近年发现,PLZF在哺乳动物雄性生殖干细胞（male germline stem cells,mGSCs）发育分化过程中也发挥重要作用.探讨PLZF的生物学功能和作用机制,将有助于理解其在mGSCs发育过程中的重要作用. 本文就PLZF在维持mGSCs自我更新和在发育分化调控中的作用给予综述.     

Refolding and purification of human papillomavirus type 16 E7-lacZ fusion protein expressed in Escherichia coli.

Human papillomavirus (HPV) type 16 E7-lacZ fusion protein was produced in Escherichia coli, extracted as inclusion bodies, refolded with reducing reagents, and subjected to gel filtration. The refolded protein was purified by ion-exchange column chromatography, resulting in a single band on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. 1H nuclear magnetic resonance spectral changes were observed in the high field methyl region in the presence of Zn2+ ion, suggesting that the refolded form of the fusion protein is possibly renaturated into the putative zinc finger motif (C. Edmond and K. H. Vousden, 1989, J. Virol. 63, 2650-2656) and supporting the data of J. A. Rawls, R. Pusztai, and M. Green (1990, J. Virol. 64, 6121-6129) on zinc binding to E7 protein using radioisotopically labeled zinc ion.