SV40增强子对奶牛β-酪蛋白启动子活性的影响

该文采用重叠PCR方法在奶牛β-酪蛋白启动子(op0)中插入SV40增强子构建重组启动子op0-SV40enh,并分析其活性。首先PCR扩增op0 5′-端2.1 Kb片段、op0 3′-端1 Kb片段和SV40增强子序列,重叠PCR拼接三种片段得到插入SV40增强子的op0-SV40enh启动子并测序鉴定后,酶切连接将其插入pGL3-Basic中的指定克隆位点,构建重组载体pGL3-op0-SV40enh。将重组载体pGL3-op0和pGL3-op0-SV40enh分别瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子op0和op0-SV40enh的相对活性。结果显示,重叠PCR拼接出长度为3.4 Kb的片段,测序结果与预期结果一致,表明成功构建了重组载体pGL3-op0-SV40enh;op0-SV40enh启动子的活性远高于op0启动子的活性,表明奶牛β-酪蛋白启动子中插入SV40增强子序列可显著提高其引导荧光素酶报告基因表达的活性。     

人转化生长因子-β2启动子区低氧反应元件突变体报告基因的构建

目的:构建人转化生长因子-β2(Transforming growth factor-β2,TGF-β2)启动子区低氧反应元件(hypoxia responsive element,HRE)突变体报告基因.方法:利用重叠延伸PCR技术,以人TGF-β2启动子区报告基因(TGF-β2-pGL3-Basic)为模板,对TGF-β2启动子区(-270bp～ 280bp)-114 bp、-73bp、-49bp、-4bp和-73/-49bp位点的低氧反应核心序列5'-RCGTG-3'分别进行定点突变,然后将此突变片段插入荧光素酶报告载体pGL3-Basic进行基因测序.结果:各突变载体的测序结果与预期完全一致.结论:人TGF-β2启动子区HRE突变体报告基因构建成功,为今后进一步研究TGF-β2的低氧调控奠定了基础.     

含p27启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p27基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p27启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果显示扩增的p27启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p27报告基因的转录。结论:克隆了p27启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

含p21启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p21基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p21启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果表明扩增的p21启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p21报告基因的转录。结论:克隆了p21启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

人Cuedc2启动子区的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定和分析人Cuedc2启动子,为进一步研究其转录调控机制和功能提供实验基础。方法:对Cuedc2基因翻译起始位点上游约2000bp的序列进行在线生物信息学分析,使用PCR技术扩增该序列并测序,将扩增获得的该片段定向克隆入PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒Cuedc2-luc。荧光素酶分析检测启动子的活性。结果:本实验成功构建了含有Cuedc2基因启动子序列的荧光报告系统,经体外验证该报告基因重组载体具有转录活性。结论:本实验所构建的Cuedc2基因启动子报告基因载体,为进一步研究Cuedc2基因的转录调控及其功能奠定了基础。     

pax2启动子的克隆及其在人胚胎肾293T细胞中的转录活性

目的:克隆paired box2(pax2)基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出pax2启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列。将重组的报告基因瞬时转染人胚胎肾293T细胞,检测pax2启动子活性。结果:测序结果显示扩增的pax2启动子序列正确;活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体α(ERα)能以剂量依赖的方式升高pax2报告基因的转录。结论:克隆了pax2启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体的构建

目的:构建解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,为寻找调控UCP1表达的小分子化合物提供有效工具。方法:从小鼠基因组DNA中PCR扩增小鼠UCP1启动子上游2000 bp序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,构建p GL3-UCP1启动子。测序正确后,提取质粒,然后将上述载体与p RL-TK载体共转染至HEK293细胞、小鼠白色脂肪前体细胞和小鼠棕色脂肪前体细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性。结果:通过PCR成功扩增获得了目的片段,并将其克隆至p GL3-basic中。与细胞内源UCP1表达水平相似,荧光素酶报告系统表明构建的p GL3-UCP1在棕色脂肪细胞中启动子活性最高,在白色脂肪细胞中活性较低,在HEK293细胞中基本没有活性。同时β3肾上腺素受体激动剂CL 316,243同样能够上调p GL3-UCP1的启动子活性。结论:成功构建了小鼠UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,并证明在棕色脂肪细胞中,该启动子具有很强的启动子活性,而在白色脂肪和HEK293细胞中,启动子活性很低。该启动子报告系统有望为寻找激活UCP1的小分子化合物提供重要平台。     

神经元限制性沉默因子对人胰岛素基因转录调控作用的研究

为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因.先用生物信息学手段对相关基因进行了分析.筛选及序列比对发现,人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列,提示,它可能受NRSF调控.构建了含NRSF基因的慢病毒载体,将其稳定转染于INS-1细胞.构建了3种荧光素酶报告载体:含有人胰岛素启动子-荧光素酶(hInsP-LUC)的慢病毒载体,pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序-荧光素酶(NRSE-LUC)的报告载体.利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响.利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况,并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性.RT-PCR检测证实,感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF,感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF.将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞,荧光素酶活性分析结果显示,NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性.瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞,结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性.将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞,结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降.电泳迁移率变动分析实验进一步证实,此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合,这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争.结果表明,人胰岛素启动子中含有NRSE样序列,该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性.这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用.     

FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性 FLT-1 启动子的真核表达栽体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力.方法:采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293 细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性.结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc栽体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞(P<0.01),而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达.结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源.     

小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及功能鉴定

利用PCR技术扩增小鼠高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因启动子序列,构建小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因pGL3-basic-HMGB1.经PCR、酶切及测序鉴定后,用脂质体法将pGL3-basic-HMGB1转入巨噬细胞264.7中,并应用萤光素酶测定系统检测其活性.检测结果显示pGL3-basic-HMGB1具有启动子活性.小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因pGL3-basic-HMGB1的成功构建,为进一步研究HMGB1提供基本材料.     

斑马鱼tnfb启动子的克隆和报告基因载体的活性分析

本研究通过采用生物信息学软件预测细胞因子tnfb基因5'上游2 000 bp左右的序列,并预测其相关的转录因子,克隆启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体,经双酶切和测序鉴定,最后通过双荧光素酶报告基因系统检测重组载体的活性。研究发现tnfb的转录因子结合位点为:Oct-1、TBP、GATA-1、RSRFC4、GLO、C/EBPα、NF-资B、ER、Pit-1a、Oct-2、Oct-2.1、RAP1。tnfb的启动子区没有发现Cp G岛,其5'侧翼序列含有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件。将tnfb的启动子片段插入p GL3-enhancer构建p GL3-tnfb-promoter-enhancer质粒后,质粒经酶切测序显示酶切片段大小一致,序列正确;转染了p GL3-tnfbpromoter的Raw264.7细胞的相对荧光素酶活性高于对照组细胞,双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的p GL3-tnfb-promoter-enhancer具有启动子活性。为研究tnfb参与的免疫相关的信号通路之间的调控提供了有力的研究工具。     

人肝癌细胞LASP1 启动子的克隆及其核心调控区域的初步鉴定

目的:克隆人肝癌细胞的LASP1基因的启动子区域并找出该基因启动子的核心调控区域。方法:提取肝癌Hep G2细胞总DNA,PCR扩增不同长度的LASP1启动子片段,克隆至PGL3-Basic载体中构建重组表达载体PGL3-P1(2059 bp)、PGL3-P2(1123bp)、PGL3-P3(909 bp)、PGL3-P4(574 bp)和PGL3-P5(159 bp),转化入大肠埃希菌(E.coli)DH5α中,提取质粒经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆并测序。将构建的重组表达载体、PGL3-Basic载体分别与内参质粒PRL-Tk共转染Hep G2细胞,48 h后经双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测其活性。结果:PCR结果、双酶切结果以及DNA测序结果表明成功构建了LASP1启动子荧光素酶报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测结果显示,与PGL3-Basic组相比,重组载体PGL3-P1、PGL3-P2、PGL3-P3、PGL3-P4均具有较强的启动子活性(P0.01),其中,PGL3-P4的活性最强。结论:成功构建了人肝癌细胞不同截断长度的LASP1基因启动子荧光素酶报告基因载体,确定了LASP-1基因启动子的核心区域(-581 bp~-8 bp),为进一步研究LASP1基因在肝癌细胞中表达的关键调节因素及分子机制奠定了基础。     

大鼠NKx6.1启动子克隆及特异性表达分析

旨在构建大鼠NKx6.1启动子的报告载体,验证转录因子T3R对NKx6.1启动子的调控活性。用PCR扩增大鼠脑组织NKx6.1的5'上游启动子片段2.4 kb,应用生物信息学方法预测该片段上潜在的转录因子T3R结合位点,根据不同的结合位点作系列截短,获得3段长度不等的启动子缺失片段,分别克隆到荧光素酶报告基因表达质粒(p GL3-Basic)上,构建相应的报告载体。将报告载体和T3R共转染大鼠星形胶质细胞(rat astrocytes,RA),并检测报告基因荧光素酶的活性。结果显示,成功构建大鼠NKx6.1启动子报告载体,双荧光素酶报告基因活性检测表明T3R对NKx6.1启动子有明显调控作用,其中-1 887 bp-1 507 bp活性最高,即存在关键顺式调控元件。克隆并筛选出启动子核心区域,揭示了甲状腺激素对大鼠NKx6.1的表达调控机制。     

小鼠TIE2基因启动子的克隆及转录活性分析

克隆小鼠TIE2基因的启动子并分析其转录活性.设计并合成引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,巢式PCR扩增小鼠TIE2基因启动子区.将扩增获得的系列截短片段克隆入荧光素酶(Luc)报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建系列启动子区转录活性报告质粒pGL3-TIE2-Luc.报告质粒与内参质粒共转染SVEC4-10、NIH3T3、HUVEC及NIT-1细胞系,48h后收获细胞检测双荧光素酶的表达情况.构建的pGL3-TIE2-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确;转染4种细胞系后进行双荧光素酶活性检测的结果表明,TIE2基因启动子区域(-2056-+1)具有较强的转录活性.成功构建小鼠TIE2基因启动子报告质粒,证实TIE2基因上游区域(-2056-+1)具有较强的启动子活性.     

人类原钙粘蛋白基因簇调控元件的克隆及对其启动子活性的影响

人类原钙粘蛋白(Protocadherin,Pcdh)基因簇包含53个成串排列非常相似的基因,组成3个紧密相连的基因簇(α,β和γ)。原钙粘蛋白基因簇γ通过启动子选择性表达产生神经元细胞膜表面的分子多样性,但是,该多样性产生的分子机制还不清楚。调控元件HS7L和HS5-1aL作为候选的增强子可能具有调控Pcdhγ基因表达的作用。利用分子克隆的方法,将调控元件HS7L和HS5-1aL分别克隆至包含γa9、γa10、γb3、γb7和γc3启动子的荧光素酶报告基因的下游。通过荧光素酶报告基因试验检测其对该5种Pcdhγ启动子活性的影响,发现HS7L对5种启动子活性具有增强作用,HS5-1aL对γa10启动子活性具有增强作用。之后,通过基因沉默绝缘子CTCF,发现下调CTCF不仅降低γb1基因表达,而且能够显著降低γb1启动子报告基因活性。试验结果表明调控元件HS7L和HS5-1aL能够增强Pcdhγ启动子活性,推测可能通过CTCF介导的增强子-启动子相互作用调控Pcdhγ的细胞特异性基因表达。     

FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性FLT-1启动子的真核表达载体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力。方法：采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性。 结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc载体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞（P<0.01）,而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达。结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源。图     

FLT-1启动子荧光素酶报告基因重组体的构建和鉴定

目的：为探索FLT-1启动子靶向调控活性分析,克隆FLT-1启动子基因序列,构建并鉴定肿-1启动子调控的荧光素酶报告基因重组体pGL3-FLT—Basic—luc。方法：应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增FLT-1启动子序列,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic—luc中,构建含有正确目的基因的报告基因重组体pGL3-FIT—Basic—luc,通过限性内切酶酶切、PCR及测序进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及基因测定证明,所克隆的基因产物与预期结果-致,序列无碱基突变。结论：成功构建了含有FLT-1启动子基因序列的荧光素酶报告基因真核表达载体,为下-步分析该启动子活性及血管疾病的基因治疗奠定基础。     

hMAM启动子／增强子调控表达载体构建和调控作用

目的构建人乳腺珠蛋白（human mammaglobin,hMAM）启动子／增强子调控报告基因表达载体,探讨hMAM启动子／增强子序列在乳腺癌细胞中的特异性调控作用。方法应用PCR技术,从基因组DNA中扩增出hMAM启动子／增强子DNA序列,构建于PGL3报告基因上游,分别转染体外培养的乳腺癌细胞MDA—MB-415、T47D及胃癌细胞7901,分析启动子和增强子序列对乳腺癌细胞的基因表达调控作用。结果酶切图谱分析、DNA序列测定表明成功构建hMAM启动子／增强子调控的表达载体;荧光素酶报告基因检测结果分析表明,hMAM启动子／增强子能够调控报告基因的表达。结论hMAM启动子／增强子,在MDA—MB-415乳腺癌细胞具有调控基因表达的作用;     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。