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《生物技术通讯》2017,(6)
目的:构建产单核细胞李斯特菌胞外蛋白p60的N端肽聚糖结合基序(p60-N)表达载体,实现其在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。方法:将目标基因克隆到表达载体pHT43中获得重组载体pHT43-p60-N,转化枯草芽孢杆菌WB800N获得重组工程菌株WB800N/pHT43-p60-N,在此基础上考察IPTG浓度、培养基、表达时间和温度等条件对目标蛋白表达的影响。结果:p60-N蛋白可在枯草芽孢杆菌中分泌表达,与鼠李糖乳杆菌形成的革兰阳性增强基(GEM)颗粒特异性结合,具有与天然蛋白类似的生物学活性。用GB培养基,在37℃下,加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导12~20 h,表达量提高到28 mg/L。结论:实现了p60蛋白N端基序在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,为进一步研究以该蛋白为基础的细菌样颗粒疫苗奠定了基础。 相似文献
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以绿色荧光蛋白为报告基因的原核启动子检测体系构建 总被引:1,自引:0,他引:1
以质粒pMUTIN-GFP 扩增获得的目的gfp 基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBE2-GFP .将组成型启动子P43和诱导型启动子Pspac克隆入pBE2-GFP ,得到重组表达载体pBE-GFP-P43和pBE-GFP-Pspac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌.荧光显微镜检测GFP 蛋白的表达情况.结果 表明,2种不同类型的启动子均能在大肠杆菌BL21和枯草芽孢杆菌1A751中启动gfp 基因的表达. 相似文献
3.
目的:以β-半乳糖苷酶为报告基因构建原核启动子检测体系.方法:以由质粒 pDL 扩增获得的 bgaB 基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体 pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBEB.将组成型启动子P43和诱导型启动子Pcpac克隆入 pBEB,得到重组表达载体 pBEBP43 和 pBEBPapac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌.结果:两种不同类型的启动子均能在大肠杆菌 BL21 和枯草芽孢杆菌 1A751 中启动 bgaB 基因的表达.结论:成功构建具有较为广泛适用性的原核启动子检测体系. 相似文献
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《生物技术》2016,(6)
[目的]构建枯草芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)原核载体,表达、纯化TrxR重组蛋白,制备并鉴定多克隆抗体。[方法]通过分子克隆获得TrxR蛋白的表达菌株;利用镍离子亲和层析获得纯化的TrxR重组蛋白,免疫兔子制备TrxR蛋白多克隆抗体;采用ELISA法测定抗体效价;Western Blot检测抗血清的特异性。[结果]TrxR重组载体双酶切结果与DNA测序鉴定结果一致,蛋白表达纯化条带大小与预测一致。ELISA法测定抗血清效价为7×104,Western Blot证实抗血清有较高的特异性。[结论]成功克隆、表达与纯化TrxR重组蛋白,制备并鉴定兔子多克隆抗体,为TrxR的生物学功能研究奠定基础。 相似文献
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炭疽芽孢杆菌EA1蛋白的融合表达和纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:原核表达重组炭疽芽孢杆菌EA1蛋白。方法:用PCR方法从炭疽芽孢杆菌A16R疫苗株染色体中扩增编码EA1蛋白的eag基因序列,经过纯化、酶切后克隆到含有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-2中,构建重组载体pGEX-EA1;将空载体(作为对照)、重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株获得表达工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western印迹检测融合蛋白的表达。结果:构建了EA1蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化获得了EA1蛋白;Western印迹表明,此蛋白可与GST标签抗体反应。结论:在原核表达系统中表达并纯化得到EA1融合蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。 相似文献
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目的:原核表达EV71结构蛋白VP0(VP2+VP4)并制备其多克隆抗体.方法:以肠道病毒71型(EV71)全基因组为模板,设计引物扩增出目的片段VP0,将其克隆至表达载体pET-30a(+),并转化大肠杆菌TG1,筛选出阳性克隆后进行测序.将重组表达载体pET-30a (+)-VP0转入大肠杆菌表达菌株Rosetta中.该重组菌经过IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE电泳和Western Blot验证后,有与预期分子量大小一致的蛋白条带,并且主要以包涵体的形式存在.包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备了VP0多克隆抗体,并对该抗体进行了细胞免疫荧光分析.结果:经过大肠杆菌重组表达并纯化得到了纯度较高的VP0蛋白,制备的多克隆抗体经过细胞免疫荧光的验证表明反应性良好.结论:成功地表达VP0蛋白并制备了其多克隆抗体,有利于EV71病毒的检测及下一步对其疫苗的研究. 相似文献
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根据苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HD-73基因Cry1Ac和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis木糖诱导型启动子PxylR序列, 分别设计2对特异引物Cry1Ac F/R和Pxy F/R,扩增获得了完整的启动子PxylR和Cry1Ac基因序列,进一步以上述产物混合物为模板,以Pxy F/Cry1Ac R作引物进行重迭PCR,获得了载体PxylR-Cry1Ac,经SphⅠ和BamHⅠ完全酶切后,将PxylR-Cry1Ac插入大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315,重组表达质粒pCry1Ac315转化枯草芽孢杆菌感受态细胞。工程菌株质粒酶切电泳分析、SDS-PAGE电泳分析和杀虫生物活性测定结果证实了Cry1Ac基因的导入及其在枯草芽孢杆菌JAAS01D中的有效表达。 相似文献
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