外源基因在转基因玉米中的整合位点分析

玉米是我国第一大作物,在保障我国粮食安全中发挥重要作用。通过转基因技术培育具有抗病虫等性状的转基因玉米新品种,可有效减少产量损失。培育的转基因玉米需要鉴定外源基因整合位点,为转基因玉米的安全性评价提供重要依据。以一个抗虫转基因玉米事件IE34为材料,采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和遗传定位方法,鉴定外源基因整合位点及旁侧序列。通过TAIL-PCR得到一段长度为776 bp的玉米基因组序列。分别在旁侧序列和外源基因上游序列设计特异性引物,建立了转基因玉米事件特异性的PCR鉴定方法。将旁侧序列在MaizeGDB中进行比对分析,发现此序列是重复序列而且存在于多条染色体上。构建转基因玉米IE34与自交系B73的F2代遗传分离群体,通过BSR-Seq方法确定外源基因整合在玉米第5染色体短臂2.32-2.70Mb区间内。通过精细定位将外源基因整合位点缩小在第5染色体2.35-2.61 Mb约260 kb的区间内。本研究结果表明,对于整合位点旁侧序列复杂的转基因事件,TAIL-PCR结合遗传定位方法能够有效鉴定外源基因的整合位点。     

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。     

转基因水稻BPL9K-2事件特异性检测方法的建立

利用hiTAIL-PCR(high efficient thermal asymmetric interlaced PCR)法扩增获得了转基因水稻BPL9K-2的外源基因插入位点的左旁侧序列450bp,与水稻参考基因组数据比对发现其左边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 765位核苷酸残基之后。根据水稻参考基因组序列和外源基因右边界序列,设计引物扩增得到485bp的特异片段,通过数据库比对发现其右边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 825位核苷酸残基之前。因为外源基因插入和非正常重组,水稻基因组上缺失了59个核苷酸。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻BPL9K-2的事件特异性定性PCR检测方法,可以分别扩增到片段大小为449bp和485bp的特异条带。该方法特异性好,灵敏度高,能够在BPL9K-2基因组DNA相对含量为0. 1%的模板中检测出转基因成分。依据旁侧序列,建立了快速鉴定转基因后代植株外源基因型的三引物PCR检测方法。这些方法的建立,为转基因水稻BPL9K-2的应用和检测提供了技术支持。     

转基因玉米2A-5特异性PCR方法的建立

根据转基因玉米2A-5的旁侧序列信息,设计并筛选出最佳特异性引物及Taqman探针组合2A-5-5-QF8、2A-5-5-QR8、2A-5-5-QP8,优化了该引物探针组合的反应体系,建立了转基因玉米2A-5转化体特异性PCR检测方法。将特异性引物及Taqman探针组合用于qRT-PCR和ddPCR技术,研究了转基因玉米2A-5转化体的定量检测方法,发现PCR定量检测转基因含量与测定样品转基因含量之间呈高度正相关。研究获得的转基因玉米2A-5转化体特异性PCR检测方法及定量qRT-PCR、ddPCR检测方法具有较高的特异性、准确性和灵敏度,是今后准确、高效检测2A-5及其产品的有效方法之一,同时也为我国转基因生物安全监管提供了良好的技术支撑。     

转基因小麦株系后代遗传稳定性的快速确证

转基因材料的遗传稳定性是基因工程成败的关键内容之一,快速确证其多代遗传特性是进行大量后代材料分析的技术保证。该文主要研究了从半粒转基因小麦B73-6-1种子中提取小麦基因组DNA的方法,并利用多重PCR技术以提取出的DNA作为模板对外源基因进行扩增,从而鉴定外源基因的遗传特性。对提取出的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析,实验结果表明,提取出的DNA产量和质量较高,而PCR的结果表明,所研究的方法可以同时扩增出两个外源基因,并利用该方法快速确证了转基因小麦B73—6—1外源udiA基因和bar基因的遗传稳定性。     

SDS-PAGE分析转基因小麦与主栽小麦杂交后代的高分子量麦谷蛋白亚基

目的:高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)1Ax1、1Dx5是对小麦面包烘烤品质有重要影响的优质亚基。将转基因小麦株系与普通小麦栽培品种常规杂交并快速筛选后代,以选育含有外源优质亚基的主栽小麦品系。方法:将分别含有1Ax1、1Dx5亚基的转基因小麦株系B102-1-2、B73-6-1与3种普通小麦主栽品种鄂恩1号、鄂麦12号、日喀则8号常规杂交,用不连续SDS-PAGE方法鉴定12组杂交组合(正反交)F1代311颗籽粒的HMW-GS。结果:不连续SDS-PAGE分析大量子代带型,能够快速鉴定筛选出具有优质亚基的株系,转基因获得的外源优质HMW-GS基因在大部分F1子代中能够共显性遗传。结论:常规杂交育种能使外源基因有效地整合进主栽小麦的基因组中,进一步分析后代遗传的稳定性和遗传规律就可以培育出优质的新品种;不连续SDS-PAGE快速筛选优质亚基的株系具有可操作性和实用性。     

转基因水稻U41三引物检测方法的建立

对于研究转基因农作物来说,建立其检测方法至关重要。本研究利用TAIL-PCR法,获得了转基因水稻U41的右旁侧序列,结果显示T-DNA插入位点在水稻1号染色体第22013～22014之间。通过设计引物扩增左旁侧序列,建立了U41转化事件特异性检测的方法,可以从含0.1%目的基因中扩增出529bp的特异性条带;还建立了三引物检测的方法,能快速和准确地鉴定U41的纯合株系。这些方法的建立,缩短了获得U41纯合体的时间,对U41的检测、研究和利用具有实用价值。     

应用实时荧光PCR技术定性定量检测改良品质的转基因小麦

目的:对转入高分子量谷蛋白亚基的小麦中转基因成分进行实时荧光PCR定性定量检测。方法:针对转基因小麦品系中通用的ubiquitin启动子,NOS终止子以及标记基因bar基因进行定性筛选检测,同时用已知为单拷贝的Wx012基因作为小麦物种内源特异参照基因,用单粒B73转基因小麦提取基因组DNA建立内源基因和外源基因的标准曲线,对转基因小麦样品A进行定量检测,同时优化实时荧光PCR条件反应条件。定量检测结果为5.35%。结果:研究的实时荧光PCR技术对转基因小麦中转基因成分能够快速准确地进行定性定量检测。     

苏云金芽孢杆菌Cry1A(b)抗虫基因LAMP检测方法的建立与应用

以转基因玉米MON810为模板,针对Cry1A(b)抗虫基因核酸保守序列设计特异性引物,建立LAMP检测体系。对该体系的可行性、灵敏性、特异性进行分析,并应用于转基因产品的检测。研究结果显示该方法快速简单、灵敏度特异性高、结果可视化,可应用于转基因产品中Cry1A(b)基因的初步筛选。     

小麦E3泛素连接酶基因TaAIRP2-1B克隆及功能分析

干旱等非生物胁迫严重影响农作物生产。本研究克隆了小麦(Triticum aestivum L.)TaAIRP2-1B基因,探讨其对非生物胁迫的响应机制,为促进小麦抗旱性的遗传改良提供基因资源。组织特异性表达模式分析显示,TaAIRP2-1B基因在小麦抽穗期的各个组织中均有表达,在茎组织中的表达水平较高,而根系中的表达水平较低。非生物胁迫表达模式分析显示,Ta AIRP2-1B受ABA、PEG及冷胁迫诱导表达。过表达TaAIRP2-1B拟南芥在0.4μmol/L的ABA处理条件下,种子发芽率显著低于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥种子萌发期对ABA的敏感性。ABA处理抑制转基因和野生型拟南芥幼苗的根系生长,但转基因拟南芥受抑制程度显著高于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥幼苗对ABA的敏感性。转基因结果表明超表达TaAIRP2-1B增强了拟南芥的抗旱性,并且转基因株系的保水率显著高于野生型。总之,本研究发现小麦基因Ta AIRP2-1B参与了植物对非生物胁迫的应答,可能是通过ABA途径正向调控植物的抗旱性。     

测墒补灌对不同穗型小麦品种耗水特性和干物质积累与分配的影响

在田间试验条件下, 以中穗型小麦(Triticum aestivum)品种‘山农15’和大穗型品种‘山农8355’为供试材料, 设置3个0-140 cm土层土壤相对含水量处理: W0 (拔节期65%, 开花期60%)、W1 (拔节期70%, 开花期70%)、W2 (拔节后8天70%, 开花后8天70%), 采用测墒补灌的方法补充土壤水分达到目标相对含水量, 对两个不同穗型小麦品种的耗水特性和干物质积累与分配进行了研究。结果表明: (1)两品种籽粒产量均以W0处理最低, ‘山农15’ W1和W2处理无显著差异, ‘山农8355’ W1处理显著高于W2处理; 两品种W1处理的水分利用效率和灌溉水利用效率均显著高于W2处理。‘山农15’ W1处理的籽粒产量和灌溉水利用效率分别显著低于和高于‘山农8355’的W1处理, 水分利用效率无显著差异; 两品种W2处理的籽粒产量、水分利用效率和灌溉水利用效率均无显著差异。(2)两品种总耗水量以W0处理最低, ‘山农15’ W1处理显著低于W2处理, ‘山农8355’两处理无显著差异; 两品种W1处理的土壤供水量及其占总耗水量的比例显著高于W2处理。‘山农15’ W1处理的总耗水量和灌水量占总耗水量的比例显著低于‘山农8355’, 土壤供水量占总耗水量的比例显著高于‘山农8355’; 两品种W2处理总耗水量, 土壤供水量及其占总耗水量的比例无显著差异。(3)两品种W1处理成熟期干物质积累量显著高于其他处理, W1处理提高了‘山农8355’开花后干物质积累量及其对籽粒的贡献率, 对‘山农15’无显著影响。‘山农15’ W1和W2处理成熟期干物质积累量显著低于‘山农8355’, 开花前贮藏同化物向籽粒的转运量和转运率、对籽粒的贡献率均显著高于‘山农8355’, 开花后干物质积累量及其对籽粒的贡献率低于‘山农8355’。综合考虑干物质积累与分配、籽粒产量、水分利用效率和灌溉水利用效率, W1处理是两品种节水高产的最佳土壤相对含水量处理。     

不同浓度硝态氮供应下小麦生长、硝态氮累积及根系钙信号特征

以小麦品种‘石麦15’和‘衡观35’为材料进行营养液水培试验,研究不同浓度硝态氮供应对小麦苗期根系形态、钙离子流特征及钙调蛋白(CaM)含量的影响。结果表明,与适宜浓度硝态氮处理(2.5mmol/L)相比,无外源硝态氮供应时小麦地上部鲜重、硝态氮含量均降低,侧根数量显著减少;高浓度硝态氮处理(50mmol/L)下两个小麦品种地上部硝态氮含量升高,根系总长度降低,‘石麦15’侧根数量减少。无硝态氮和高浓度硝态氮处理下,根系中钙调蛋白含量降低,且‘衡观35’的降低幅度大于‘石麦15’。无外源硝态氮供应时小麦根尖表现出较为明显的钙离子外流特征;与适宜浓度硝态氮处理相比,高硝态氮处理下小麦根尖Ca2+的内流速度显著下降。说明硝态氮供应不足和高浓度硝态氮供应会影响小麦根系生长,根系Ca2+外流或Ca2+内流速度下降,CaM含量减少,Ca2+/CaM可能介导硝态氮调控小麦根系生长发育。     

水稻和小麦根尖细胞壁多糖的铝积累能力比较

采用水培法比较4种禾本科植物水稻（Oryza sativa L.）、玉米（Zea mays L.）、高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）和小麦（Triticum aestivum L.）8个基因型的抗铝（Al）能力,并对他们在Al积累后细胞壁的多糖组分进行分析。结果显示,在5~200 μmol/L Al处理下,水稻抗Al能力较强,而小麦抗Al能力较弱。在50 μmol/L Al处理下,小麦根尖的果胶和半纤维素1含量的增幅明显高于水稻。水稻基因型‘日本晴’与‘浙辐802’的细胞壁Al含量分别占根尖总Al含量的78.7%和91.6%;小麦基因型‘扬麦18’与‘扬麦16’Al含量分别占根尖总Al含量的64.9%和72.1%。Al吸附-解吸实验结果显示,小麦根尖细胞壁上Al的吸附量高于水稻。研究结果表明,细胞壁是Al积累的主要部位,对Al敏感的水稻和小麦基因型细胞壁中的Al主要分布在果胶中;而对Al耐性较强的水稻和小麦基因型细胞壁中的Al主要分布在半纤维素1中。     

干旱胁迫下亚精胺对玉米幼苗抗旱性影响的生理生化机制

为探究外源亚精胺(Spd)在增强玉米干旱胁迫耐受性中的作用,以‘先玉335’(干旱不敏感型)和‘丰禾1’(干旱敏感型)为试验材料,采用营养液水培法,研究了15%聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫下,外源Spd (0.1 mmol·L^-1)对玉米幼苗生长、光合特性、叶绿素含量、渗透调节物质、活性氧生成、膜质过氧化及根系活力的影响.结果表明:干旱胁迫下,外源Spd处理可显著促进干旱胁迫下玉米幼苗的生长;提高叶绿素含量、净光合速率(P_n)、气孔导度(g_s)、蒸腾速率(T_r)和水分利用效率(WUE),减缓‘丰禾1’叶片中胞间CO₂浓度(C_i)的升高,有效减轻干旱胁迫对玉米幼苗叶片光合作用的气孔限制和非气孔限制;增加脯氨酸和可溶性糖的含量;降低O₂^-·生成速率、H₂O₂和丙二醛(MDA)含量、细胞膜透性,有效缓解了胁迫对膜的伤害;增强幼苗根系活力;其中干旱敏感品种‘丰禾1’变化幅度大于耐旱品种‘先玉335’.表明在干旱胁迫下,外源Spd能促进玉米幼苗对光能的捕获与转换,增强光合作用,促进幼苗的生长,并能够通过减少玉米幼苗体内活性氧的产生,增加渗透调节物质的积累以稳定细胞膜系统,提高根系活力,从而增强幼苗对干旱逆境的适应性,且对干旱敏感品种‘丰禾1’的效果更显著.     

不同番木瓜品种植株感染环斑花叶病毒后PAL、PPO、POD活性的变化

对不同品种番木瓜接种环斑花叶病毒后,测定植株苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)的活性变化,比较各品种的抗病性。结果表明,未接种的5个品种间PAL、PPO、POD活性差异较小,其酶活性水平次序为马来10号> 蜜红3号> 马来6号> 马来2号> 台农2号。接种后,5个品种的PAL、PPO、POD活性明显高于各对照水平,其中马来10号变化最突出,台农2号变化最缓慢。     

Quantification of Fusarium culmorum in Wheat and Barley Tissues Using Real-Time PCR in Comparison with DON Content

A real‐time polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for the specific detection of Fusarium culmorum in infected seeds. Primers and TaqMan minor groove binder probe were derived from the sequences of a F. culmorum specific PCR product. The specificity of the assay was confirmed by test in seven Fusarium species and 21 non‐Fusarium fungal species. With serial dilutions of purified genomic DNA from F. culmorum isolate B as the template, the detection limit of the assay was found to be 0.9 pg of fungal genomic DNA per reaction. A significant correlation ( = 0.982) and collinearity was found between DNA concentration and Ct (cycle threshold) values of real‐time PCR assay with serial diluted DNAs extracted from three seed samples with different deoxynivalenol (DON) content. Eight barley and nine wheat varieties infected by F. culmorum isolate B were evaluated in 1 (barley samples) and in 4 years (wheat samples). The results of real‐time PCR analysis and enzyme‐linked immunosorbent assay testing for DON content were compared and a significant correlation was found for barley samples (r² = 0.935). Concerning wheat we found rather complicated relationship between Ct values and DON contents influenced by environmental conditions of field trials. The real‐time PCR assay was found to be highly specific and sensitive. It could be used in phytopathological studies and praxis.     

Event-specific qualitative and quantitative PCR detection of roundup ready event GT73 based on the 3′-integration junction

With the development of genetically modified organisms, labeling regulations have been introduced, which require appropriate detection methods. Event-specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction (PCR) detection methods have become the internationally agreed state-of-art. This paper describes an event-specific PCR method for qualitative and quantitative of Roundup Ready canola event GT73. The 3′-integration junction was characterized by two methods: inverse-PCR and thermal asymmetric interlaced-PCR. In the conventional qualitative PCR assay, the event-specific primers designed were confirmed to be specific and the limit of detection (LOD) was 0.05% (approximates to ten haploid genome copies). In the quantitative TaqMan real-time PCR assay, the LOD and the limit of quantification were five and ten haploid genome copies, respectively. In addition, for further quantitative detection, a reference molecule which contained the canola endogenous gene and event-specific sequence was constructed and standard curves were set up. The goodness of the linearity and high efficiency of the PCR reaction indicated the usability of the plasmid and the established PCR system. Moreover, mixed samples with different GT73 content (6, 3, 1 and 0.5%) were quantified using the established real-time PCR system to evaluate the trueness and precision of the system. The trueness expressed as bias varied from 2.00 to 18.00%. The precision expressed as variation coefficient were different from 6.40 to 32.95%. From above results, we believed that the established event-specific qualitative and quantitative PCR systems for GT73 in this study were acceptable and suitable for genetic modified canola detection. Rong Yang, Wentao Xu and Yunbo Luo contributed equally.     

不同定植期和摘心方案下5个品种(系)茶用菊生长和产量性状的变化

为了比较5个茶用菊新品种(系)的产量水平,并筛选出获得高产的定植期和摘心方案,以 ‘苏菊10号’、‘苏菊12号’、‘苏菊13号’、‘CH1-44’、‘CH5-13’ 为试材,采用三因素裂区试验设计,主区为早、中、晚3个定植期,裂区为5个新品种(系),裂裂区为4种摘心方案,比较不同栽培措施下植株生长和产量的差异.结果表明: 5个新品种(系)中,‘CH5-13’和‘苏菊13号’产量相对较高,‘CH1-44’和‘苏菊10号’产量次之,‘苏菊12号’产量最低;5月27日中期定植、二次摘心措施下5个新品种(系)的株高、冠幅、单株花数、花径、单花鲜质量、单株产量和单位面积产量均显著优于其他处理,较5月7日和6月13日定植分别提高16.0%和19.0%、18.0%和22.8%、36.7%和42.2%、11.1%和2.3%、13.0%和4.0%、47.8%和36.6%、48.5%和36.7%.随着摘心时间的推迟,株高显著降低,二次摘心株高较不摘心降低50.2%;二次摘心处理的冠幅、单株花数、单花鲜质量、单株产量和单位面积产量最高,较不摘心依次提高17.0%、29.1%、5.5%、34.0%和34.8%.品种(系)、定植期、摘心方案3个因素对茶用菊生长性状和产量影响作用的大小依次为:定植期>品种>摘心.     

小麦TaHDA19基因的克隆及胁迫表达分析

利用基因克隆技术从小麦（Triticum aestivum L.）品种‘科农199’中扩增得到一个RPD3/HDA1型组蛋白去乙酰化酶基因TaHDA19,采用生物信息学方法对该基因序列的结构特征进行分析,并对植株不同组织及不同胁迫条件下该基因的表达量进行检测。结果显示：TaHDA19的开放阅读框长1560 bp,共编码519个氨基酸;该基因的氨基酸序列存在组蛋白去乙酰化酶（HDAC）家族典型的结构域Hist-deacety1。该基因上游启动子区含有多种响应元件,如：光响应元件I-box和G-box,脱落酸响应元件ABRE和低温响应元件LTR等。‘科农199’TaHDA19基因的表达结果表明：该基因在根、茎、叶片和幼穗中均有表达,其中在叶片中表达量最高;采用脱落酸、氯化钠和PEG分别处理植株0、1、3、6、12、24 h后,基因的表达水平出现差异;在对植株的12个生育时期进行35℃和42℃热胁迫处理1 h后,该基因表达量均出现上调。研究结果表明TaHDA19可能在小麦响应非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

外源亚精胺对盐碱胁迫下番茄幼苗根系线粒体功能的影响

为探讨外源亚精胺(Spd)对盐碱胁迫下番茄根系线粒体功能的影响,采用水培法,以耐性不同的两个番茄品种‘金棚朝冠’（耐盐型）和‘中杂9号’（敏感型）为试材,通过模拟盐碱生态条件(NaCl∶Na₂SO₄∶NaHCO₃∶Na₂CO₃=1∶9∶9∶1),结合叶面喷施外源0.25 mmol·L^-1Spd,研究盐碱胁迫8 d后Spd对番茄幼苗根系形态和根系线粒体功能的影响.结果表明： 盐碱胁迫下,两个品种番茄根系线粒体内H₂O₂和丙二醛（MDA）含量增加,线粒体膜通透性明显增大,流动性降低,膜电位、线粒体内细胞色素c/a(Cyt c/a)吸光度比值、膜H⁺-ATPase活性显著下降,使线粒体受到不同程度的损伤,从而抑制根系生长,且‘金棚朝冠’的上述指标变化幅度均小于‘中杂9号’.盐碱胁迫下,喷施外源Spd处理的两个品种根系线粒体H₂O₂和MDA含量显著降低,膜通透性减小、流动性增加,膜电位、线粒体内Cyt c/a吸光度比值、膜H⁺-ATPase活性显著提高,可有效缓解盐碱胁迫对番茄幼苗根系线粒体的伤害作用,且这种缓解作用在‘中杂9号’上的表现效果更佳.