表达重组别藻蓝蛋白质粒在工程菌株中的遗传稳定性研究

将含有表达重组别藻蓝蛋白基因的重组质粒pMal-2X的工程菌株P1分别在含有Amp的LB固体培养基上采用划线法连续传代至100代,其生长速度（在LB培养基中）、菌落形态和抗生素抗性等方面与原始种子库无明显差异;取第10,20,50,100代提取质粒DNA经EcoRI限制性内切酶酶切检查,酶切图谱没有改变。DNA测序未见apc基因变异。原代菌株与传代第10,20,50和100代菌株经诱导培养,其rAPC表达水平、菌体蛋白的SDS—PAGE图谱及重组蛋白的免疫原性均无明显差异。以上结果表明,重组质粒pMal-2X在工程菌株P1中具有良好的遗传稳定性。     

表达重组别藻蓝蛋白质粒在工程菌株中的遗传稳定性研究*

将含有表达重组别藻蓝蛋白基因的重组质粒pMal-2X的工程菌株P1分别在含有Amp的LB固体培养基上采用划线法连续传代至100代,其生长速度(在LB培养基中)、菌落形态和抗生素抗性等方面与原始种子库无明显差异;取第10,20,50,100代提取质粒DNA经EcoRⅠ限制性内切酶酶切检查,酶切图谱没有改变。DNA测序未见apc基因变异。原代菌株与传代第10,20,50和100代菌株经诱导培养,其rAPC表达水平、菌体蛋白的SDS-PAGE图谱及重组蛋白的免疫原性均无明显差异。以上结果表明,重组质粒pMal-     

重组别藻蓝蛋白β亚基（His-β~（APC））表达菌株遗传稳定性的研究

工程菌株的遗传稳定性在目的产物的生产应用中至关重要。为了确定工程菌株的遗传稳定性,通过对重组别藻蓝蛋白β亚基（His-βAPC）生产菌株E.coliJM109（DE23）/pET28α-βAPC进行了菌体生长量的测定,平板划线,质粒酶切,产物鉴定等研究,检验了该工程菌质粒的稳定性。通过实验得到如下结果：该工程菌株在没有抗生素选择压力下传代,质粒丢失率为5代6%,10代8%,15代9%,20代15%;该菌株经固体平板连续划线传代20次后,菌落大小和形态基本不变;质粒经BamHⅠ和HindⅢ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳结果显示该菌株携带的重组质粒目的片段在传代前后没有发生变化;经诱导培养后,His-βAPC在原代和第5、10、15和20代宿主菌中都可以表达,表达量没有明显差别,且表达产物在SDS-PAGE中的带型基本一致。以上结果表明,该工程菌质粒具有结构稳定性和分裂不稳定性。     

重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性

目的通过菌株传代方法观察携带致死因子(lf)基因的重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性。方法将重组菌株pET-28(a)/LF/BL21在含有卡那霉素的LB培养基中连续传代至100代,比较第1、10、20、50、100代菌株的菌落形态、细菌形态、生化特性、质粒保有率、生长速度等的差异;取各代次菌株提取质粒DNA且分别进行双酶切及PCR鉴定、DNA测序;诱导表达各代次菌株,比较各代次菌株的重组rLF蛋白的表达水平及免疫反应性。结果各代次菌株菌落形态、生化特性、生长速度等方面与原始种子库无明显差异;在传至100代时的质粒保有率为76%;各代次菌株重组质粒电泳图谱、酶切图谱、PCR图谱未改变,未见lf基因变异;各代次菌株的总蛋白电泳图谱r、LF蛋白表达量r、LF蛋白的免疫反应性与原始种子库无明显差异。结论重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21具有较好的传代稳定性。     

一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag 的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag 的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。     

碳源对K.fragilis LFS-8611β-D-半乳糖苷酶合成的影响

探讨了碳源对脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)LFS-8611生长、β-D-半乳糖苷酶合成的影响及碳源对该酶合成的诱导作用。脆壁克鲁维酵母(K,fragilis)LFS-8611生长与β-D-半乳糖苷酶合成同步。该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之。菌体生物量和酶活力随着培养基中乳糖浓度的增加而增加,乳糖浓度为12mg／mL,菌体生物量和酶活力达到峰值,分别为5．84g／L、19,12U／mL。半乳糖和乳糖对β-D-半乳糖苷酶合成具有诱导作用。诱导物浓度对β-D-半乳糖苷酶的诱导合成有较大影响。半乳糖诱导以山梨醇为碳源预培养的K．fragilis LFS-8611细胞合成β-D-半乳糖苷酶的最适浓度为10mg／mL。     

L-天冬酰胺酶工程菌株培养条件及稳定性

L-天冬酰胺酶工程菌株的酶活和表达水平受菌体生物量和诱导时间的影响。在生物量Ａ６００03×１０左右,热诱导4h酶活力和表达水平可达到较高水平。葡萄糖对酶的生成有阻遏作用,当葡萄糖浓度大于025%时,对工程菌酶的合成造成阻遏。确定了工程菌培养的培养基、pH值、接种量等因素。重组质粒pASN在\%E.coli\% JM105,TG1和AS1357等宿主菌中具有很好的稳定性,工程菌培养50代以上重组质粒保留90%以上,在LB和M\|3培养基中也较稳定。     

阴道乳杆菌耐热β-半乳糖苷酶的鉴定

利用改良的MRS培养基,从鸡粪样本中分离到多株产β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株。酶学性质分析发现,菌株1-1产生的β-半乳糖苷酶在37℃~60℃相对稳定,37℃酶活力达到183.9NLU/g菌体干重。进一步分析16S rRNA基因序列,确定菌株1-1为阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)。扩增分析β-半乳糖苷酶编码基因lacL和lacM,结果发现LacL亚基有642个氨基酸,LacM亚基有321个氨基酸,与罗伊氏乳杆菌MM2-3相应蛋白的相似性分别为86%和84%。     

一株产低温β-半乳糖苷酶微杆菌的筛选鉴定、产酶条件及其酶学特性

【背景】低温β-半乳糖苷酶能在低温下仍保持较高的乳糖水解活性,筛选酶学特性适合在牛乳体系中高效水解乳糖的β-半乳糖苷酶生产菌株,是低乳糖牛乳加工产业关注的焦点。【目的】对天山中国一号冰川沉积物中分离的一株产低温β-半乳糖苷酶菌株的产酶条件和酶学特性进行研究。【方法】结合X-Gal平板法初筛和测定粗酶液酶活复筛,获得产低温β-半乳糖苷酶的菌株。通过形态学、生理生化试验及16S rRNA基因测序分析对筛选菌株进行鉴定,单因素摇瓶实验优化菌株的产酶条件,硫酸铵分级沉淀初步纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行分析。【结果】通过形态学、生理生化特征和16S rRNA基因鉴定,确定菌株LW106为微杆菌属(Microbacterium)菌株;该菌株最适产酶温度为25°C,最佳产酶碳源为可溶性淀粉,培养基初始pH为7.0,接种量为3%;对初步纯化的低温β-半乳糖苷酶酶学性质的研究表明,LW106所产β-半乳糖苷酶的最适pH为6.0,最适反应温度为35°C,4°C时酶活为最大酶活的78%,4°C和pH 7.0时的稳定性最好,10 mmol/L的Na+对酶活性基本没有抑制作用,Ca~(2+)对酶活性具有一定的激活作用。【结论】菌株LW106所产低温β-半乳糖苷酶的酶学特性表明该酶在乳品低温加工领域具有进一步研究和应用的价值。     

表达重组咖啡豆α-半乳糖苷酶的酵母工程菌的高密度发酵

用5 L发酵罐优化了重组咖啡豆α-半乳糖苷酶酵母工程菌pPIC9K-Gal/GS115(本室构建)的高密度发酵工艺.通过对发酵条件的优化,包括甘油补充量及补充时机、甲醇诱导量及诱导时机、溶氧控制、诱导时间等,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了高效表达.利用所确定的最适条件进行发酵,菌体密度最终达到368 g/L以上,每批发酵液离心后可获得3.5 L的发酵上清,上清中的蛋白含量达到3 g/L以上,目的蛋白占上清总蛋白的50%以上,含量约为1.5 g/L,上清中α-半乳糖苷酶的活性维持在80 U/ml左右.确立工艺后又进行了3次发酵试验,证明了工艺的可行性和稳定性.为重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在B→O血型改造和酶解大豆低聚糖方面的应用奠定了基础.     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GAL1的穿梭表达质粒pYESZ中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4－3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β-半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β-卜半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4－3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β-半乳糖苷酶在pep4－3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。     

云南传统发酵豆豉中产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究

目的从云南豆豉样品中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌,并对其产酶条件进行研究。方法从云南省元阳、红河、建水、石屏等地采集豆豉样品,并从中分离得到355株微生物。结果经明胶诱导、脱脂乳平板实验,复筛得到87株蛋白酶产生菌,从中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌。通过X-Gal平板实验,共获得34株产β-半乳糖苷酶菌株,通过酶活测定,最终筛选得到1株高产β-半乳糖苷酶菌株GJ-1-3L,经16S rDNA序列分析鉴定为短乳杆菌;GJ-1-3L在以葡萄糖为碳源、多聚蛋白胨为氮源、起始pH 6.5的MRS培养基中,接种量为4%,35℃发酵培养12 h,其β-半乳糖苷酶活性高达6.73 U/mL,Cu2＋、Ba2＋对酶活有抑制作用,而K2HPO4、MgSO4则能促进酶活。结论 GJ-1-3L菌株来源于豆豉,能够产生β-半乳糖苷酶发酵乳糖,同时产生乳酸,其在食品与乳品加工等方面具有很好的应用前景。     

鸡γ-干扰素基因重组质粒在工程菌株中的稳定性研究

本文通过传代的方法研究了鸡γ-干扰素基因的重组质粒pET-ChIFN-γ在工程菌CH1中的遗传稳定性.结果表明重纽质粒在没有筛选压力下存在质粒不稳定性,100代时质粒稳定性只有69%.适当的筛选压力可以显著降低质粒的遗传不稳定性,100代时稳定性提高到95%.各代重组菌株在生长性能、质粒酶切图谱、蛋白表达等方面均保持一致,未见明显差异.生物活性检测原代和100代均达到1.0×105 IU/mL以上.以上结果表明重组质粒pET-ChIFN-γ在工程菌株CH1中具有良好的遗传稳定性,其质粒遗传不稳定性可由适当的筛选压力来控制.     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β一半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GALl的穿梭表达质粒pYES2中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4-3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β一半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β一半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4-3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β一半乳糖苷酶在pep4-3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。     

产α-半乳糖苷酶嗜热芽孢杆菌的选育

α-半乳糖苷酶催化棉子糖的水解,可以提高甜菜制糖中的蔗糖得率。我们从专性嗜热芽孢杆菌中筛选到α-半乳糖苷酶的菌株T59(尚未鉴定)。该菌株生长温度在45—60℃范围内,本实验培养温度为55℃。     

通过非甲醇诱导游离型表达载体改善毕赤酵母中β-半乳糖苷酶表达

β-半乳糖苷酶是一种重要的食品工业用酶,目前主要通过毕赤酵母甲醇诱导型表达系统进行生产,但甲醇的使用存在火灾、残留毒性等安全隐患,已逐渐成为食品工业用酶生产中备受关注的问题之一.为满足β-半乳糖苷酶安全生产的需要,本研究利用强组成型启动子PGCW14和源自酵母的自我复制序列PARS构建了一种新型非甲醇诱导游离型表达载体pGCW14ZαA-PARS,并且在此基础上分别构建了非甲醇诱导游离型重组表达菌株KM71/pGCW14ZαA-PARS-Aoβ-GAL,用以改善米曲霉Aspergillus Oryzae RIB40(ATCC42149)来源的β-半乳糖苷酶基因(Aoβ-GAL)在毕赤酵母中的表达.实验结果表明,该非甲醇诱导游离型表达载体在毕赤酵母中传代培养90代后仍保持83.22％的遗传稳定性,完全能够满足工业上大规模生产的需要.在10％流速补充碳源的条件下,非甲醇诱导游离表达菌株KM71/pGCW14ZαA-PARS-Aoβ-GAL经高密度发酵的最高酶活性和比活性分别为126.4 U/mL和26.2 U/mg,分别是传统甲醇诱导型表达菌株KM71/pPIC9k-Aoβ-GAL的1.94倍和3.12倍,且发酵周期缩短了36h.可见,本研究构建的非甲醇诱导游离型表达载体可有效改善β-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的表达,且在食品工业用酶的安全、高效工业化生产中具有一定的应用前景.     

短双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶基因aga1在大肠杆菌中的高效表达

短双歧杆菌（Bifidobacterium breve 203）α_D_半乳糖苷酶基因(aga1)被克隆到大肠杆菌温度诱导表达质粒pBV220中,构建重组质粒pBVaga1,转入大肠杆菌进行温度诱导表达,得到的重组酶Aga1在大肠杆菌DH5α、DH10B和BL21中的比活分别为28.08、19.44和13.85U/mg, 均高于短双歧杆菌α_D_半乳糖苷酶的比活1.76U/mg。重组质粒pBVaga1在E. coli BL21中稳定性较好。重组酶Aga1蛋白亚基分子量约67kD,最适反应温度为45℃,酶在40℃以下稳定,60℃仅剩余约5%的酶活性,70℃时酶全部失活;最适反应pH为4.0～4.4,酶在pH 3.6～6.0范围内稳定;酶对p_硝基苯酚_α_半乳糖苷的Km＝1.43mmol/L,Vmax＝35.71μmol/(L·min),对蜜二糖的Km＝261mmol/L,Vmax＝63.69μmol/(L·min);酶在蜜二糖、棉子糖水解体系中不显示转糖基活性。结果说明Aga1与已经报道的一种短双歧杆菌的α_D_半乳糖苷酶不同,是新发现的一种短双歧杆菌的α_D_半乳糖苷酶。     

人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化

通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+ )-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础.提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA.以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90ABl.将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经Nde I和Sal I双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆.挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+ )-hHsp90AB1.重组质粒转化Rosetta( DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13％.接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶素和层析,蛋白纯度达到98％.     

B→O血型转变工具酶α-半乳糖苷酶cDNA克隆及表达

 α-半乳糖苷酶是实现 B→O血型转变、制备通用型血的关键工具酶 .利用反转录 PCR方法从中国海南 Catimor咖啡豆中克隆α-半乳糖苷酶 c DNA,插入嗜甲基酵母 P.pastoris分泌表达载体 p PIC9K中 ,转化 P.pastoris GS1 1 5,筛选高表达重组菌株 .经甲醇诱导表达 7d后 ,发酵液总蛋白分泌量约 1 .2 mg/ml,SDS- PAGE呈现约 41 k D特异表达带 ,与专一性底物对 -硝基 -苯基 -α- D-吡喃半乳糖苷反应证明 ,表达产物具有 α-半乳糖苷酶活性 ,最高达到 1 8U/ml.初步实验表明 ,表达的 α-半乳糖苷酶可酶解 B型红细胞 ,成功实现 B→O血型转变 .