意大利科学家成功地克隆一种人体酶

意大利一个由四位科学家组成的小组(属遗传和生物物理国际研究所,意大利Napies,小组负责人L,Luzzatto,45岁)成功地将一种人体酶克隆。上周意大利国家研究委员会这样说,这是在历史上第一次使这种酶产生一种精确的复制品。该组研究者D.Toniolo在一次电话上说:“我们仅克隆了一个分子的很小一部分”。复制的分子DNA     

一种新的DNA分子克隆方法

DNA分子克隆是基本的分子生物学实验技术,传统的分子克隆方法大多需经过酶切链接过程,但在某些情况下,没有合适的酶切位点往往会成为阻碍克隆进行的障碍.本文描述了一种新的分子克隆方法,称为不依赖酶切和链接的分子克隆（RLIC）.利用RLIC,将3种不同大小的DNA片段克隆到3种不同载体,证明了这种方法的有效性和可靠性.由于该方法不受限制性酶切序列限制,省去了酶切连接步骤,因此具有很大的灵活性和简便性,在分子生物学研究方面有广泛应用前景.     

基于抗性恢复的高效克隆超短片段重组质粒的构建

分子克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的分子克隆中,主要通过限制性内切酶先分别消化目的 DNA片段及载体,再纯化回收,然后用DNA连接酶将二者连接。而对一些超短基因片段(300 bp),通过酶切及切胶纯化后,回收率极低,导致插入表达载体比较困难。文中介绍了一种新的利用质粒抗性恢复进行克隆的方法,大大提高了克隆效率,为短基因片段的分子克隆提供了一种高效的方法。     

分子克隆中使用的其他酶(续)

除限制性内切酶外,还有许多其他酶在分子克隆中被广泛应用,其性质将在下面给出。对有些酶,我们给出其详细的反应步骤与条件,而另一酶,我们给出文献,请读者自己找出其反应条件。为完整起见,在这里还介绍了分子克隆中几种不常见酶的性质,     

外切核酸酶Ⅲ介导的DNA分子克隆

DNA克隆技术,作为最基本的现代分子生物学实验技术之一, 已经成为生物医学研究领域的重要研究手段。传统的分子克隆方法需要经过限制性内切酶酶切和DNA连接酶连接的步骤,是否存在合适的酶切位点和DNA连接酶的效率成为影响克隆的重要限制因素。本文描述了一种由外切核酸酶Ⅲ介导的,以3′-5′外切核酸酶活性和细菌细胞内DNA修复机制为理论基础的DNA分子克隆方法,称为不依赖连接酶的分子克隆（ligation-independent cloning, LIC）|证明了该方法的高效性和可靠性,并进一步对酶的用量、反应温度、反应时间、片段载体比例和量等多个参数进行了优化,建立了一种快速、简便和高效的DNA克隆方法。     

玉米线立体类质粒的克隆和鉴定

S型细胞质雄性不育玉米的线粒体类质粒S-1为一个长6.4kb的双链线状DNA分子。本文对基本上全长的S-1（只用限制内切酶PstI在两端各切掉128bp）在pUC18和pBR322两种质粒中进行了克隆得到4种杂合的质粒。限制性酶切图谱证明它们分别是S-1以不同方向克隆在两种质粒中的结果,Southern印迹杂交也证明S-1克隆在pBR322中.     

木质素酶降解接近商业化了吗?

<正> 造纸中用微生物降解木质素还未达到商业阶段的原因主要是这一过程太慢。然而,通过遗传工程成功地生产出的木质素降解酶可以改变这一状况。美国路易斯安娜州立大学V.R.Srinivasan领导的一个研究小组成功地克隆了一种酶,并在大肠杆菌中得到表达。它能够切开在木质素中大量存在的芳基-烷基(aryl-alkyl)和芳基-烷基酯键。木质素是树木     

克隆破骨细胞特异的人组织蛋白酶K

明海大学口腔解剖学教授久米川正好、前助手手(?)健一和日本汽巴嘉基国际研究所生物有机化学研究部小组负责人小久保利雄、稻冈哲也等小组克隆了新的组织蛋白(半胱氨酸蛋白分解酶)——人组织蛋白酶K。上月将DNA序列输入到欧洲分子生物学研究所(EMBL)的数据库。组织蛋白酶K在破骨细胞中特异地表达,其表达量有可能在进行骨吸收的酶中是最高的。如果能开发特异性高的抑制剂,就能发展成骨质疏松症的治疗药。     

用羟基磷灰石柱分级洗脱法纯化小牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶和DNA聚合酶

DNA分子体外重组一般有两种方法。一种是限制性核酸内切酶—DNA连接酶方法此法缺点是要求克隆的DNA和载体DNA都必须具有粘性末端,如无粘性末端,必须加大DNA连接酶的酶量才能重组;另一种方法为末端转移酶法,其优点是任意的两种DNA     

从噬菌体随机肽库中筛选流感病毒神经氨酸酶的抑制多肽

目的:从噬菌体呈现12肽库中筛选与流感病毒神经氨酸酶特异性结合的肽。方法:以甲三型流感病毒裂解疫苗原液为靶分子,经过3轮生物淘选,从噬菌体随机肽库中筛选与之结合的噬菌体。用ELISA方法鉴定噬菌体克隆与靶分子的结合力,用荧光方法测定噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶的抑制活性。对筛选到的阳性克隆进行DNA序列测定并推导出相应的氨基酸序列。结果:经过3轮筛选后,42个噬菌体克隆与靶分子有高度亲和力,23个噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶有抑制活性。对27个噬菌体克隆的测序结果表明,分别有10个和2个克隆的序列是一致的,其氨基酸序列分别为KSLSRHDHIHHH和WPRHHHSASVQT。结论:通过噬菌体肽库筛选到抑制流感病毒神经氨酸酶的12肽,为进一步研究对流感病毒神经氨酸酶有抑制活性的分子药物奠定了基础。     

一个RNAi载体上反向重复片段的测序策略

相邻的反向重复DNA片段有形成单链内二级结构的倾向,属于一种测序困难的DNA模板。解决RNAi载体插入的反向重复片段的测序问题,为该类载体正确性的测序验证奠定基础。采用常规分子克隆方法构建表达小麦TaATG2串联反向重复片段的RNAi载体,设计2种策略对经菌落PCR初步鉴定的载体进行测序验证:一种是以完整的载体质粒为模板进行测序;另一种是先对载体进行酶切处理,切除反向重复片段中的一个后对保留另一个片段的线性载体进行测序。结果表明,第一种测序策略受到串联反向重复片段形成的单链内部二级结构的影响,测序信号在反向重复片段处出现衰减或乱峰,无法读取序列。第二种测序策略排除了2个反向重复片段之间的干扰,保留在载体上的片段测序信号清晰,序列准确。采用酶切切除一个片段后进行测序的方法,经过2次酶切和2次测序可以有效地对载体上的2个反向重复片段分别进行序列测定,进而确认构建载体的正确性。     

一种简单有效的克隆未知旁侧DNA片段的方法

操作含长插入片段的DNA克隆时 ,经常需要进行亚克隆和测序实验。通常的方法首先是得到插入片段的限制性内切酶谱 ,然后选择合适的内切酶消化DNA ,分离靶片段 ,将其连接入质粒载体中进行下一步操作。但这种方法工作量大 ,步骤繁琐。在此 ,介绍一种不需要做限制性内切酶谱分析 ,而根据靶片段的旁侧序列直接进行亚克隆实验的方法。首先 ,选择合适的限制性内切酶消化含长插入片段的DNA克隆 ,其中一种酶切在已知的旁侧序列上 ,另一为随机选择 ;然后酶切混合物与线性化的质粒载体连接 ,转化细菌得到一“亚克隆库” ;将其中的克隆挑选入 96孔板培养后 ,按行或列混合菌液得到相应的“pool” ;最后 ,用PCR方法筛选获得含靶DNA片段的阳性克隆 ,其中所用的引物一个与已知的旁侧DNA序列配对 ,另一个与质粒载体上序列配对 ,PCR扩增已知的旁侧DNA片段以鉴定阳性克隆。多次独立实验表明该方法简单有效 ,可广泛用于亚克隆和DNA步移实验     

意大利蝗海藻糖酶基因克隆及卵低温驯化下的表达模式

[目的]本研究通过克隆意大利蝗Calliptamus italicus卵海藻糖酶基因,分析其在蝗卵不同发育阶段的表达及低温驯化后的表达变化,阐明海藻糖酶基因在意大利蝗卵抵御低温胁迫过程中的作用.[方法]利用RT-PCR技术扩增蝗卵海藻糖酶基因的ORF全长序列,并进行生物信息学分析;利用RT-qPCR分析检测常温(27℃...     

分子酶工程学研究进展

酶工程的研究已经发展到分子水平,通过基因操作,已实现了许多酶的克隆和表达。定点突变成为研究酶结构与功能的常规手段,并被广泛用于改善酶的性能。体外分子进化方法则大幅提高了酶分子的进化效率,并有可能发展新功能酶。融合蛋白技术的发展使构建新型多功能融合酶成为可能。这里对分子酶工程学的研究与发展情况进行了综述。      

大脑关键神经元受体基因的克隆

日本京都大学的Shigetada Nakanishi研究小组克隆了大鼠NMDA受体蛋白的基因,而美国堪萨斯大学的Elias Michaelis则克隆了一种NMDA受体蛋白。NMDA受体是脑中的重要神经元膜蛋白,是谷氨酸受体中的关键因子。这两个小组的成功将使他人较易于检测用于控制NMDA受体、治疗与谷氨酸有关的疾病的药物。这类疾病包括退化性脑失常、中风、癫痫及记忆丧失。 Nakanishi及其同事在Nature杂志上详细描述了他们的工作。Michaelis则在最近一次神经科学学会议上介绍了自己的工作。自1989年12月以来,已克隆了12种不同的谷氨酸受体,其中,NMDA受体被认     

科研快讯

《临床研究期刊》:胃部一种糖链缺失可致胃癌日本一个研究小组最新报告说,实验鼠胃黏膜中的一种糖链缺失会引发胃癌,早期胃癌患者胃部这一糖链也出现减少甚至消失,因此可据此寻找预防胃癌的方法。糖链是葡萄糖、半乳糖等糖类分子按特定序列形成的链状物。日本信州大学医学部教授中山淳率领的研究小组在美国《临床研究期刊》网络版上刊文说,胃黏膜产生的液体中含有一种糖链,这种糖链含有α型N乙酰氨基葡萄糖。研究人员通过基因技术,培育出胃黏膜不产生这种糖     

凝血酶受体的克隆

科学家们最终可能发现了通过凝血酶信号形成血块.加利福尼亚大学(San Francisco,CA)的一个研究小组已经鉴定和克隆了一种受体,这种受体是在血小板和内皮细胞的表面     

实验5 DNA片段的亚克隆

DNA片段的亚克隆通常包括连接、转化、筛选、鉴定等步骤。 一、载体的选择 根据待亚克隆的DNA片段的两端顺序、用途(如准备作DNA顺序分析、大量扩增或作酶切图谱分析等)和载体DNA分子带有的限制酶位置,选定合适的载体。     

谷氨酸棒状杆菌启动子在枯草芽孢杆菌中的克隆及其序列分析

利用枯草芽孢杆菌启动子探针质粒pPL 603为载体,从谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA上克隆到一个有较强启动功能的DNA片段。生物素标记的DNA—DNA分子杂交实验证明该片段确实来自谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA。在绘制该片段限制酶酶切图谱的基础上,经另一个启动子探针质粒pPL 703的亚克隆,将其启动子功能区定位在Bamm酶切片段中。对后者进行了核苷酸序列分析,发现它具有棒状杆菌类启动子的－35区和－10医序列。     

产纤维素酶细菌的工程化

Oak Ridge National Laboratory的研究人员对一种细菌进行遗传工程,使之生产纤维素酶,这种酶可用作纺织中的去垢剂,使蓝劳动布纤维变得平滑。 上述研究小组的负责人Craig Dees博士介绍说:“工程化细菌产生的酶比真菌同期产生的多得多。在蓝