里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GS115中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47)。该酶的全长cDNA共1481bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员。诱导培养72h时重组酶活可达到1.067U/mL,蛋白含量为440mg/L。重组酶的最适反应温度为60°C,在30°C～65°C比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定。这是首次关于Armillariella. tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料、食品、药物生产等方面有广泛的应用。     

假密环菌Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GSIl5中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47).该酶的全长cDNA共1481 bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员.诱导培养72 h时重组酶活可达到1.067 U/mL,蛋白含量为440 mg/L.重组酶的最适反应温度为60℃.在30℃～65℃比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定.这是首次关于Armillariella.tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料,食品、药物生产等方面有广泛的应用.     

里氏木霉双基因同步缺失菌株的构建与甘露聚糖酶表达研究

在里氏木霉中建立了一个快速的双基因位点同步同源重组新方法,较好解决了里氏木霉基因逐个敲除周期长等问题。研究以里氏木霉自身甘露聚糖酶基因（man5A）为重组表达的报告基因,通过一步转化,将该基因定点整合入纤维二糖水解酶Ⅰ（cbh1）基因位点,同时缺失主要的两个纤维素酶基因（cbh1、cbh2）,得到重组工程菌Man12。将重组工程菌Man12与出发菌株Tu6Δku70进行摇瓶发酵,结果显示,重组菌株的甘露聚糖酶产量比出发菌株提高10倍,而纤维素酶产量降低了60%,胞外总蛋白分泌水平降低了40%。Real-time PCR检测甘露聚糖酶基因（man5A）的转录水平,发现重组菌株较出发菌株提高了25倍。在里氏木霉中首次报道了通过一步转化实现两个基因同步定点整合的方法,对利用基因工程手段构建高效表达重组蛋白的里氏木霉工程菌株具有一定的指导意义。     

葡萄穗霉中β-甘露聚糖酶基因在黑曲霉中的表达及酶学性质

【目的】以黑曲霉(Aspergillus niger)为宿主菌来表达葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)中的β-甘露聚糖酶(β-mannanase)基因。【方法】通过对葡萄穗霉全基因组进行比对分析,获得编码β-甘露聚糖酶基因s16942和s331的序列信息,通过设计引物,PCR扩增得到基因s16942和s331,连接到载体pGm上,并转化到黑曲霉中,获得的转化子经过amdS二筛平板复筛,测序验证,得到高效表达此基因的工程菌株G1-pGm-s16942和G1-pGm-s331。【结果】SDS-PAGE检测结果显示,G1-pGm-s16942和G1-pGm-s331表达的蛋白分子量大小分别约为48 kDa和60 kDa,且阴性对照中没有此条带。粗酶液的酶学性质表明,G1-p Gm-s16942表达的β-甘露聚糖酶的最适反应温度为60°C,最适反应pH为7,粗酶液的酶活最高达521 U/mL;G1-p Gm-s331表达的β-甘露聚糖酶的最适反应温度为50°C,最适反应pH为7,粗酶液的酶活最高达84 U/mL。【结论】本研究首次将葡萄穗霉的β-甘露聚糖酶基因转化到黑曲霉中并成功表达,并且具有较高的活性。     

耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析

目的:克隆黑曲霉β-甘露聚糖酶基因,研究该基因在毕赤酵母中的表达情况。方法:运用RT-PCR从黑曲霉AN070902中克隆β-甘露聚糖酶cDNA片段,与载体pPIC9K相连,构建重组载体VMAN-pPIC9K,电转化毕赤酵母GS115,筛选产酶最高菌株进行5 L液体发酵,对该菌株所产重组酶进行酶学性质分析。结果:克隆获得1152 bpcDNA,编码由383个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质属于GH5家族,理论pI和相对分子质量分别为4.48和41.6×103;筛选获得的重组菌株VMAN-pPIC9K-GS115在5 L液体发酵中上清酶活达11 785 U/mL;表达的重组酶是一种酸性β-甘露聚糖酶,最适反应pH值为3.0,经pH2.0～9.0处理2 h后剩余酶活保持90%以上;该重组酶最适反应温度为65℃,70℃处理1 h后剩余酶活保持75%以上;该重组酶活性被1 mmol/L的Fe3+和Mn2+显著抑制,被1mmol/L的Co2+显著激活。结论:重组耐酸性β-甘露聚糖酶的特性,决定了其在工业生产中,特别是动物饲料和食品加工中具有应用价值。     

哈茨木霉A25-2纤维二糖水解酶玉基因的克隆及其编码催化功能域的序列在绿色木酶HP35-3中的表达

本研究从哈茨木霉(Trichoderma harzianum) A25-2总RNA中利用RT-PCR的方法扩增到其纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列,并对该基因编码的氨基酸序列进行分析,得到cbhI基因中编码催化功能域的序列。将催化功能域编码序列克隆到表达载体pCP-GH中,用PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法将重组质粒转化到绿色木霉(Trichoderma viride) HP35-3中,筛选得到12个转化子。以p-NPC为底物,测定了该12个转化子的酶活力,获得比活力最高的转化子Tv/CDHl-CBM-5,其纤维二糖水解酶活力是HP35-3的3.8倍。SDS-PAGE分析表明,绿色木霉表达了导入的含A25-2纤维二糖水解酶I催化功能域的编码序列。     

里氏木霉纤维二糖酶bglII基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达*

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行 RT-PCR合成约1.4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型表达载体pJW2中,经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子,温度诱导后,经酶活测定,bgl II基因在大肠杆菌中得到了表达,酶活为0.75IU/mL。     

里氏木霉纤维二糖酶bgl II基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行 RT-PCR合成约1.4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型表达载体pJW2中,经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子,温度诱导后,经酶活测定,bgl II基因在大肠杆菌中得到了表达,酶活为0.75IU/mL.     

一种耐热偏酸性β-甘露聚糖酶基因克隆与高效表达

【目的】克隆半纤维素降解高效菌株Bacillus subtilis BE-91的甘露聚糖酶基因并进行原核表达,对表达产物进行酶学性质研究。【方法】采用PCR扩增法从B. subtilis BE-91菌株中克隆β-甘露聚糖酶基因,分别连接到pEASY-E1和pET28a载体,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。用DNS法对工程菌株的胞内和胞外β-甘露聚糖酶进行定量分析,选取胞外甘露聚糖酶活力高的组分进行酶学性质研究。【结果】从B. subtilis BE-91菌株中克隆的β-甘露聚糖酶基因(GenBank登录号：KP277209)在E. coli中获得高效表达,工程菌株pEASY-man/BL产胞外β-甘露聚糖酶的活性可达229.1 IU/mL;该基因序列全长960 bp,包含319个氨基酸的编码序列和一个终止密码子;表达产物的最适反应温度为65 °C,最适反应pH为6.0,属于耐热偏酸性β-甘露聚糖酶;该酶稳定温度≤65 °C,稳定pH为4.5?7.0;1 mmol/L的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+对该酶有激活作用,而Ba2+和Pb2+有强烈抑制作用。【结论】B. subtilis BE-91拥有珍贵的β-甘露聚糖酶基因资源,其胞外表达产物的耐热偏酸性酶学性质在开发饲料添加剂方面具有潜在的应用前景。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

Armillariella tabescens EJLY2098β-甘露聚糖酶的诱导、纯化及酶学性质分析

Armillariella tabescens EJLY2098经魔芋精粉诱导,可产β-甘露聚糖酶,再用正交实验优化诱导培养基,结果在培养基为魔芋精粉2％、蛋白胨1％、土豆汁25％、KH2PO4 0.3％、MgSO4·7H2O 0.15％、维生素B1 0.01％时可诱导出较高活性的酶。用DEAE－阴离子交换色谱从培养上清分离纯化β-甘露聚糖酶,出现2个活性组份。 活性组份P2 的SDS-PAGE分析,发现为电泳纯的一条带,分子量约78.9kD。 HPTLC分析, P2为内切β-甘露聚糖酶;酶反应的最适温度为60℃,最适pH 为4.0～6.0。保温30min的半失活温度t1/2为63℃,在pH 4.5～6.0之间稳定性较好。Na+和Ba2+对其有激活作用,等电点pI约为4.0～4.1。本研究获得了一株产β-甘露聚糖酶的新菌种,为进一步用基因工程方法克隆并构建具有完整自主知识产权的重组β-甘露聚糖酶基因工程菌提供了一个重要的基础工作。     

黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA在PK15细胞中的分泌表达

通过RT-PCR方法,从黑曲霉总RNA中克隆出β-甘露聚糖酶基因manA的成熟肤编码序列.将其与猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肤序列通过重叠延伸PCR方法得到拼接片段,并插入到真核表达载体pcDNA6.0/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-PSmanA.重组质粒经过PCR、酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且读码框完全正确.在脂质体介导下将pcDNA-PSmanA转染猪肾(PK15)细胞进行分泌表达,通过RT-PCR方法证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测酶活性得到β-甘露聚糖酶基因酶活性为14.5 IU/mL.     

重组海栖热袍菌极耐热甘露聚糖酶的纯化和性质研究

研究了海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8甘露聚糖酶基因(TM_1227)的克隆、重组酶的纯化和性质.该基因全序列2010 bp,编码669个氨基酸,分子量为76.827 kD.根据氨基酸同源性分析,该β-甘露聚糖酶与Thermotoga sp.RQ2来源的β-甘露聚糖酶(GenBank登录号ACB09927.1)同源性最高,为99%.重组转化子经IPTG诱导酶比活可达39.7 U/mg蛋白.粗酶液经金属亲和层析,得到电泳纯甘露聚糖酶.以槐豆胶为底物时,该酶的最适反应温度和pH分别为95℃和pH 8.0,85℃处理30min酶活保存50%以上,很有潜力用于高温、偏碱性的造纸工业.对椰子甘露聚糖和槐豆胶的主要水解产物是不同聚合度的甘露寡糖,几乎没有单糖生成,适合生产低聚甘露糖.     

纤维素酶制备过程中不同底物、菌种的研究

比较用两个菌（黑氏木霉Ｔrichoderma reesei RutC-30及其改良菌种）和不同的纤维底物备纤维素酶解效果与酶系构成,研究表明,以玉米秸秆米为底物,发言奶菌种产酶时间比里氏木霉早２天,且改良菌种滤纸酶活要比里氏木霉高,分别为２．３９ＦＰＩＵ／mL和１．８５ＦＰＩＵ／mL,里木氏霉已实际运用到生产工艺中,如把改良菌种运用至生产工艺必将产生可观的经济效益。     

β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达

目的:实现β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达。方法:克隆猪肠道野生酵母菌JSY4的25S rDNA片段;并与YIP5经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切连接,构建载体YIP5-rDNA。BamHⅠ与SalⅠ双酶切YIP5-rDNA,EcoRⅠ与SalⅠ双酶切pGEM-ManⅠ得到ManⅠ基因,BglⅡ与EcoRⅠ双酶切pPIC9K得到AOX1启动子,将三个片段连接,构建高拷贝整合诱导型表达载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ。提取DNA用SalⅠ单酶切线性化与pAX15按3∶1的比例共转化JSY4,在含300μg/mlG418的YEPD平板上筛选工程菌转化子,PCR方法鉴定。用2%甲醇诱导共转化工程菌以实现表达。结果:成功表达出β-甘露聚糖酶,其比活力为0.90IU/ml。而且传代10次后仍能检测到ManⅠ基因的表达产物β-甘露聚糖酶。结论:实现了β-甘露聚糖酶基因随共转化工程菌染色体稳定遗传及表达的目的。     

里氏木霉纤维二糖酶bg1Ⅱ基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链，并以之为模板进行RT－PCR合成约1．4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型载体pJW2中，经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子，温度诱导后，经酶活测定，bg1Ⅱ基因在大肠杆菌中得到了表达，酶活为0．75IU／mL。     

里氏木霉α-半乳糖苷酶基因agl2在毕氏酵母中高效表达

通过反转录PCR从里氏木霉RutC-30 基因中克隆到α-半乳糖苷酶基因agl2,将其构建到具有AOX1强启动子的表达载体pPIC9K中,线性化后转化到毕氏酵母GS115中进行表达。结果表明agl2基因在毕氏酵母GS115中得到了高效表达,在50 L发酵罐中高密度发酵168 h,酶活达最高值1 106 U/mL。经PCR产物鉴定,结果表明agl2基因已整合到毕氏酵母GS115基因组中。     

硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的组成型分泌表达

目的：构建硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母组成型分泌表达菌株,研究重组菌株的产酶水平。方法：EcoR I／Xba I双酶切质粒pPIC-mann-opt,琼脂糖凝胶电泳、回收目的基因片段后,与组成型毕赤酵母表达载体pGAPzαA连接,转化大肠杆菌,经筛选获得含有pGAP-mann-opt的重组克隆;提取pGAP-mann-opt,用限制性内切酶BspH I线性化后,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,进行Zeocin抗性筛选和PCR鉴定。结果：获得了重组菌株,重组菌株在YPD培养基中摇瓶发酵24h,上清液酶活达到343U／mL,产酶蛋白约为1.0mg／mL。结论：构建的硫色曲霉β-甘露聚糖酶组成型表达菌株具有较好的应用前景。     

Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶atMAN47的纯化及酶学性质分析

以魔芋精粉为唯一碳源, 对假蜜环菌(Armillariella tabescens) EJLY2098进行培养, 诱导其产生β-甘露聚糖酶。经DEAE－阴离子交换层析后, 分离纯化出β-甘露聚糖酶atMAN47。酶学性质分析: 该酶分子量约为47 kD, 酶的最适反应温度为50°C, 在pH 5.0~6.5之间该酶的稳定性较好; Na+ 和Ba2+ 对该酶有激活作用, 用TLC对酶产物分析, 表明该酶为内切β-甘露聚糖酶。该酶为偏酸性的内切甘露聚糖酶, 适合发展为饲料的酶制剂, 具有良好的应用前景。