利用RT_PCR、DNA序列分析及原核基因表达对我国大豆花叶病毒进行分子鉴定(英文)

大豆花叶病毒（ＳＭＶ） 在大豆（ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．） 上引起严重病害。利用ＲＴ＿ＰＣＲ 扩增并克隆了ＳＭＶ＿ＺＫ（ 一个中国ＳＭＶ 分离株） 基因组中全部蛋白质编码区的ｃＤＮＡ。通过对ＨＣ＿ＰＲＯ、ＮＩｂ 和ＣＰ编码区进行序列测定与分析,发现ＳＭＶ＿ＺＫ 与ＳＭＶ＿Ｇ２ 高度同源,从而在分子水平上证明在我国大豆作物中存在ＳＭＶ＿Ｇ２ 类似株系。将ＳＭＶ＿ＺＫｃＤＮＡ克隆于细菌表达载体,获得并提纯了６ 种ｃＤＮＡ 的表达产物。这项工作将为进一步研究ＳＭＶ 基因组的功能奠定基础。     

广西黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）黄瓜分离物的RT—PCR检测及CP基因序列分析

利用黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber Green Mottle Mosaic Virus,CGMMV）的特异性引物对来自广西一温室栽培的黄瓜病样进行RT—PCR检测,结果扩增得到了与预期大小相符的目的片段（650bp）。序列分析表明,该目的片段包含有CGMMV完整的CP基因序列、部分运动蛋白基因（MP）及3’端非编码区（3＇-UTR）序列,其中CP基因全长486bp,与已报道的CP基因序列同源性为91．2％～99．4％。经系统发育分析,明确该GX-CS分离物与日本、法国、印度等分离物属于CGMMV同一类群,并推测该分离物与广西的葫芦（GX—BG）分离物具有相同的起源关系。     

大豆花叶病毒黄淮5号株系的基因组全序列分析

测定了大豆花叶病毒(SMV)我国黄淮5号(Y5)株系的基因组全序列.该病毒基因组全长9*!585个核苷酸,3′-末端具poly(A)尾,包含单一开放读码框,编码一个349.2kD的多聚蛋白.基因组全序列和美国SMV G2和G7株系的核苷酸同源性分别为97.4%和96.9%.多聚蛋白酶解后产生马铃薯Y病毒属典型的10个成熟蛋白.Y5、G2和G7 3个株系的不同成熟蛋白间氨基酸序列的同源性为89.6%～100%.多重比较分析表明,Y5株系P1蛋白N-末端区域与G2和G7存在明显差异.进一步分析显示,这3个株系的6K1、6K2、NIa-Pro、NIa-VPg、NIb蛋白中心区域和CP蛋白高度保守,P1蛋白N-末端,CI和P3蛋白C-末端以及HC-Pro蛋白变异较大,但是美国G2和G7株系已报道序列P1蛋白区域存在可能的测序错误.     

绵羊线粒体DNA控制区5‘端序列PCR—SSCP与序列分析

通过绵羊线粒体DNA控制区功能域（5‘端序列）PCR－SSCP和序列分析,发现小尾羊、乌珠穆沁羊、湖羊、萨福克羊和夏洛来羊以及多赛特公羊与尾寒羊杂交家系共202只绵羊可归纳为两种类型,突变型和野生型,提示现代绵羊品种在起源上存在两种主要的进化途径。     

花椰菜花叶病毒(新疆分离物)基因组DNA的全部核苷酸序列

用Maxam-Gilbert化学切断法,从含全长病毒DNA的克隆pCaMV C17中,测定了CaMV-XJ基因组的全部核苷酸序列。CaMV-XJ DNA含有8,060个碱基对。在不同的译读相位中,CaMV基因组含有6个主要ORF或可能的基因,与其他巳作全序列测定的三个CaMV分离物比较,有三个显著的差别;(1)ORFⅥ编码的氨基酸变化达16％,显著高于其他区域的变化和其他三个分离物之间的差别,(2)在ORFⅣ的近氨基末端有39bp的插入,它与被插入区的序列几乎是直接重复;(3)由于核苷酸置换而引入了终止信号,所以T.Hohn[2]推测,可能存在的ORFⅦ不可能编码有功能的蛋白。     

烟草花叶病毒蚕豆株系基因组全序列分析及结构特征

根据已报道的TMV-U1株系核苷酸序列合成引物 ,利用RT-PCR技术获得了覆盖整个烟草花叶病毒蚕豆株系 (TMV-B)基因组的cDNA重组克隆 .结合末端测序技术 ,完成了TMV-B全基因组序列测定 .TMV-B全基因组共有 6 395个核苷酸组成 ,包括 4个开读框 (ORF) ,分别编码 1 2 6ku(含 1 1 1 6个氨基酸 )、1 83ku(含 1 6 1 6个氨基酸 )、30ku(含 2 6 8个氨基酸 )和 1 7.5ku蛋白 (含 1 5 9个氨基酸 ) .TMV-B与TMV-U1相比全基因组同源率达 99.4% ,两病毒基因组 5′ ,3′非编码区和CP基因完全相同 .TMV-B与TMV-U1之间在 1 2 6ku蛋白中有 6个氨基酸差异 ,5 4ku蛋白中有 2个差异 ,30ku蛋白中有 3个差异 .对导致TMV-B侵染蚕豆的可能致病机理进行了分析 .     

侵染白术的大豆花叶病毒的全基因序列测定及分析

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)是影响大豆产量与质量的重要病原体,且自然寄主范围窄。本研究对疑似感病白术叶片进行非序列依赖性扩增(sequence-independent amplification,SIA)检测,结果表明,感病白术为SMV侵染,并命名为SMV-Am。为明确其基因组结构特征及系统进化关系,本研究利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)提取、RT-PCR及RACE技术对其进行全基因组扩增,并进行生物信息学分析。结果表明,SMV-Am基因组全长9 587 nt,具有显著的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)基因组结构特征;核苷酸与氨基酸序列相似性分析表明,SMV-Am与来自中国的SMV-Liaoning分离物相似性最高,核苷酸与氨基酸序列相似性分别为96.57%和98.86%;系统进化分析也显示与SMV-Liaoning分离物亲缘关系最近;对SMV-Am蛋白序列进一步分析发现,存在与功能位点相关的氨基酸突变,经I-TASSER和PyMOL软件进行蛋白建模分析,发现SMV-Am的P1、HC-Pro、P3、6K2、NIa-Pro、NIb蛋白结构均发生不同程度的变化,且P1蛋白最明显;重组分析结果显示,在SMV-Am基因组的6 560~8 950 nt位置存在重组事件,其主要亲本和次要亲本分别为SMV-XFQ012(GenBank登录号:KP710875.1)和SMV-pCB301-SC15(GenBank登录号:MH919386.1)。这是SMV侵染白术的首次报道,研究结果有望为防范SMV病害在白术上爆发流行以及防治提供科学依据。     

南方鲇生长激素完整cDNA的克隆及其DNA序列分析

采用RT-PCR法和3'、5'RACE(Rapid amplification of cDNA ends）法从南方鲇脑垂体RNA克隆出生长激素(Growth hormone,GH）cDNA。此cDNA全长1087nt(含Rloy(A)),其5'端非编码区长52nt、阅读框（Open rdading frame,ORF）长603nt、3'端非编码区长415nt。其推导的GH由200个氨基酸组成,其中前24个氨基酸为信号肽部分。氨基酸序列比较表明,南方鲇（GH）与Pangasianodon gigas、Ictalurus punctatus 和Heteropneustes fossilis三种鲇类的同源性分别为97.5%和95.0%,与鲢、鳙、草、鲤鱼的GH同源性达76.0%以上,而与人的GH(I、Ⅱ)同源性最低为31.0%和29.5%。     

中国大豆花叶病毒SC7外壳蛋白基因的序列测定及其与美国株系的比较

为了探索大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)SC7外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列与病毒致病性作用及其与美国株系的对应关系,本研究通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),克隆了我国SMV SC7株系的CP基因,并测定了其全序列。结果表明:CP基因长度为795bp,编码的CP蛋白为265个氨基酸。在致病性反应上,SC7的毒力比美国的毒株更强些。在分子水平上,CP基因核苷酸序列差异为4%~5%,编码的氨基酸序列差异为1%~2%。美国株系N端都存在与蚜传有关的保守基序DAG(Asp-Ala-Gl),但在SC7为DAD(Asp-AlaAsp)。将序列信息与SMV株系在鉴别寄主上的症状反应进行综合分析发现,CP基因的同源性与SMV在鉴别寄主上的致病性反应没有明显关系。     

建兰花叶病毒运动蛋白基因克隆及序列分析

从建兰花叶病毒（CyMV）石斛兰分离物中提取病毒RNA,用反转录——聚合酶链式反应(RT-PCR)方法获得约500bp的运动蛋白基因片断,插入pGEM-T载体克隆并测序。序列分析表明,该基因片断由474个核苷酸组成,和CyMV美国夏威夷分离物、新加坡分离物相应基因核甘酸序列分别具有97.8%同源性;根据核酸序列推导该片断含有3个部分重叠的开放阅读框架（ORF）,分别编码14kD、12kD和10kD的多肽。     

建兰花叶病毒运动蛋白基因克隆及序列分析

从建兰花叶病毒 (CyMV)石斛兰分离物中提取病毒RNA ,用反转录———聚合酶链式反应 (RT PCR)方法获得约 5 0 0bp的运动蛋白基因片断 ,插入 pGEM T载体克隆并测序。序列分析表明 ,该基因片断由 474个核苷酸组成 ,和CyMV美国夏威夷分离物、新加坡分离物相应基因核甘酸序列分别具有 97.8%同源性 ;根据核酸序列推导该片断含有 3个部分重叠的开放阅读框架 (ORF) ,分别编码 14kD、12kD和 10kD的多肽     

中国大豆花叶病毒SC7外壳蛋白基因的序列测定及其与美国株系的比较北大核心CSCD

为了探索大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）SC7外壳蛋白（Coat protein,CP）基因序列与病毒致病性作用及其与美国株系的对应关系,本研究通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）,克隆了我国SMV SC7株系的CP基因,并测定了其全序列。结果表明：CP基因长度为795bp,编码的CP蛋白为265个氨基酸。在致病性反应上,SC7的毒力比美国的毒株更强些。在分子水平上,CP基因核苷酸序列差异为4%~5%,编码的氨基酸序列差异为1%~2%。美国株系N端都存在与蚜传有关的保守基序DAG（Asp-Ala-Gl）,但在SC7为DAD（Asp-AlaAsp）。将序列信息与SMV株系在鉴别寄主上的症状反应进行综合分析发现,CP基因的同源性与SMV在鉴别寄主上的致病性反应没有明显关系。     

木蓝根瘤菌的16S rDNA全序列分析及DNA—DNA杂交

通过数值分类,ＳＤＳ－全细胞蛋白电泳分析,对分离自西北黄土高原地区的木蓝根瘤菌进行了研究,获得了１个新类群。在此基础上,进行了中心菌株ＳＨＬ０４２的１６Ｓ ｒＤＮＡ全序列分析,得到系统发育树状图。ＳＨＬ０４２与Ｒ．ｔｒｏｐｉｃｉ Ａ、Ｒ．ｔｒｏｐｉｃｉ Ｂ、Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、Ｒ．ｅｔｌｉ、Ｒ．ｈａｎａｎｅｓｉｓ、Ｒ．ｍｏｎｇｏｌｅｎｓｅ和Ｒ．ｇａｌｌｉｃｕｍ构成一个发育分支,其与这些     

侵染辣椒的黄瓜花叶病毒CP基因的序列分析、原核表达及抗血清制备

从吉林长春感病辣椒上获得一黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分离物(CMV-CC),根据GenBank中已登录的CMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因核苷酸序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法克隆到了长度为657 bp的目的片段。序列分析表明,CMV-CC与CMVI组各分离物核苷酸同源性为93.2%-97.9%。根据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:38个CMV分离物可分为3个组,CMV-CC属于CMV的IB亚组。将CMV-CC CP基因与原核表达载体pET-22b(+)连接,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达出分子量约27 kD的融合蛋白。表达的融合蛋白经树脂纯化后免疫家兔制备了抗血清。用间接ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting分析表明制备的抗血清对CP有高度特异性,为准确、快速地检测CMV奠定了基础。     

一种简易的利用Pfu—DNA聚合酶进行反向长距离PCR获得定点突变的 …

定点突变是一种常用的分子生物学方法。利用Ｐｆｕ－ＤＮＡ聚酶进行反向长距离Ｐ衣效地获得定点突变。方法担任简易、突变效率高于９０％。整个操作过程可在一个试管中完成,不需亚克隆。对克隆在大所粒（如转化植物的Ｔｉ－类型质粒）尤为实用。     

利用Taq DNA聚合酶对PCR产物直接进行顺序分析

Taq DNA聚合酶具有反应速度快、温度作用范围广及良好的续进性等特点,可视为一种理想的DNA顺序分析酶。本文首先对非对称性PCR扩增过程中单、双链DNA产物的积累情况进行了分析,然后采用标记延伸二步法,对Taq DNA聚合酶的性质及影响因素进行分析。为进一步改进Taq DNA聚合酶测序的方法,本反应建立了“Klenow-型”的直接掺入标记同位素测序法,即在反应液中加入与标记核苷酸相应的一定浓度的冷dNTP。此法不但解决了二步法中引物后部分DNA顺序无法读出的缺点,而且简化了反应步骤,亦能得到令人满意的顺序分析结果,每次可读出至少400碱基的序列。     

扩展青霉PF898碱性脂肪酶基因组DNA的克隆及序列分析

扩展青霉 (Penicilliumexpansum)PF898可产生一种具有重要工业生产价值的碱性脂肪酶(PEL) .在通过 3′RACE和 5′RACE获得PEL完整的cDNA序列的基础上 ,通过PCR方法首次克隆了该脂肪酶的完整的基因组DNA序列 (GenBank登录号为AF330 6 35 ) .该脂肪酶DNA全长 14 0 4bp ,包括PEL编码区、3′非翻译区和部分 5′非翻译区基因的序列 .编码区DNA由 1135个碱基组成 ,含有 5个内含子 ,大小分别为 5 8bp、4 7bp、5 0bp、5 6bp和 6 9bp .在已报道的丝状真菌脂肪酶中 ,PEL基因的内含子数量最多 ,而其大小与其它丝状真菌脂肪酶基因的内含子一样 ,均为只有几十个碱基的小内含子 .PCR扩增获得的PLEDNA序列还包括由 195个碱基组成的 3′端非编码区序列 ,74个碱基的部分 5′端非编码区序列 .PELDNA全长序列中的 - 2 4至 - 2 7nt为TATAbox ,终止码TGA下游15 6nt出现AATAAA序列 ,TGA下游 182位出现poly(A)尾 ,为典型的真核基因结构 .同源性序列分析表明 ,PEL与其它真菌来源脂肪酶的基因组DNA序列同源性约为 39%～ 4 9% ,PEL内含子之间或PEL内含子与其它丝状真菌脂肪酶基因的内含子之间的序列同源性约 4 2 %～ 5 7% .