pUB 110质粒转化枯草杆菌Ki-2株及其突变体的研究

迄今文献中报道枯草杆菌基因克隆化都采用枯草杆菌168株及其突变体。本文采用我国分离的枯草杆菌Ki-2株及其突变体Ki-2-1 32(Thr~-Ile~-Val~-)和Ki-2-148(ura~-)为pUB110质粒DNA的受体菌株。用酸酚法提纯pUB110质粒DNA,在琼脂糖凝胶电泳上看不到样品中有染色体DNA的带。结果表明,Ki-2、Ki-2-132和Ki-2-148都可作pUB 110质粒的受体菌,其转化频率在10~(—3)—10~(—8)之间,因菌株和条件不同,频率有所差异。Ki-2-132的转化效率为每微克DNA可产生10~4转化体。pUB 110质粒DNA浓度在0.01—1.00μg/ml之间时,转化体数目随DNA浓度增加而增加,其中,在浓度为0.01—0.1μg/ml之间成直线关系,测定的DNA依赖指数为1.04,系一级反应。从pUB110质粒DNA转化168、Ki-2、Ki-2-132、Ki-2-148的转化体中提取的质粒DNA仍具有pUB110质粒DNA的抗卡那霉素的转化活性。从转化体提纯的质粒DNA的电泳图以及EcoRI消化后的电泳图与原来的pUB110 DNA的电泳图相同。     

枯草杆菌和大肠杆菌融合转移双复制功能杂种质粒pTZ22的研究

在大肠杆菌C600(pTZ22)(Km~rTc~rAp~r)和枯草杆菌Ki-2-132(Sm~rIle~-Thr~-Val~-)(简称A系统)以及在枯草杆菌Ki-2-132(pTZ22)(Km~r)和大肠杆菌C600(简称B系统)菌株之间,通过细胞融合,从两个方向转移pTZ22。A系统获得一批抗Km Sm融合子,B系统获得一批抗Km Ap和Tc的融合子,融合频率为10~(-4)—10~(-6)。融合子的抗性是稳定的,并且革兰氏染色、产酶和产孢匦与不带质粒的亲本相同。DNA的电泳图证明,除了不带质粒的亲本无质粒带外,其它菌株都有质粒带,A系的电泳相同,B系的则不同,原因尚不清楚。用融合子的质粒DNA转化ki-2-132和C600都获得了转化体,其转化频率因实验条件不同而有差异。以上结果表明,大肠杜菌和枯草杄菌细胞之间能够相互融合,通过融合能从A、B两个方向转移质粒pTZ22,枯草杆菌的蛋白酶不阻碍细胞融合和质粒转移。     

枯草杆菌Ki-2-132株运载体质粒pKC1的构建和特性

pc194质粒在枯草杆菌(Bacillus subtilis)Ki-2-132株中的稳定性比在168株中的稳定性高。在EcoRI位点将质粒pUB110(Km~c)和pTP-4(Cm~r)重组,获得重组质粒pKC1(km~c Cm~c)。电镜照片表明pKC1 DNA是一环状分子。它可转化Ki-2-132获得同时抗Km和Cm的转化体,其稳定性介于二亲代质粒之间,但更接近于较稳定的pUB110。pKC1在Km~c基因内有单一的BglⅡ切点,在该位点上克隆Ki-2染色体无选择记号的BglⅡ、BamHI或BglⅡ-BamHI片段,获得插入失活的Km~s Cm~r转化体,其中一个(pK15)插入DNA片段的分子量约为1.5Md。pK15稳定性比pKC1低,但还可相当稳定地保持在Ki-2-132中。结果表明,Ki-2-132和pKG1是一个克隆外源DNA的系统。     

多粘芽孢杆菌质粒的研究——Ⅱ.多粘芽孢杆菌原生质体形成、再生与转化

多粘芽孢杆菌P250-2完整菌体不能作为质粒DNA的转化受体,但其质粒消除菌株P_0250-5制成的原生质体,可接受多粘芽孢杆菌的pBD2502及枯草杆菌的pUB110质粒DNA转化。在高渗蔗糖再生培养基上,原生质体再生率为20％左右,形成率在95％以上。在含新霉素(10μg/ml)、青霉素(25μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)的高渗蔗糖再生培养基上分别获得了转化子。多粘芽孢杆菌的转化频率为3.29×10~(-3),枯草杆菌为4.4×10~(-4)。转化子的形态表现、生化特性和抗菌谱与给体菌株一致,表明多粘芽孢杆菌株间及多粘芽孢杆菌和枯草杆菌种间的质粒可以进行转化。     

枯草杆菌中通过细胞融合的质粒转移

在PEG存在下,枯草杆菌BD366(pUB110)菌株和G1菌株的原生质体以10~(-6)—10~(-4)的融合率发生融合。在染色体的抗药性标记、营养要求和一般细菌学特征鉴定方面,多数融合子相似于亲本G1,所不同的是质粒上的抗药性标记相同于另一亲本菌株BD366,并且在高渗培养基上具有独特的菌落形态。融合子的以上一些特征极为稳定。高温能使质粒pUB110消除,质粒消除后融合子的菌落形态转变成为亲本G1的形态特征。我们认为双亲细胞融合后没有发生遗传重组,而是在分裂过程中发生分离,于是质粒pUB110可能出现在G1细胞中,因此本文为通过细胞融合的质粒转移和由于某一特定质粒的存在而改变菌落形态提供了初步证据。     

短小芽孢杆菌作为芽孢杆菌属基因工程受体菌的研究

以质粒pUB110 DNA转化B. pumilus 289原生质体,转化频率为10~(-3)—10~(-9)与B.tubtilis 168系统相当;但B.pumilus 289原生质体的再生频率(0.3—12.0％)略低于B.subtilis 168(1.53—24.16％);在无选择压力条件下质粒pUB110在B.pumilus 289中经过45个世代周期,自发丢失率小于3％,同于B.subtilis 168系统。外源基因在B.pumilus 289中经25个世代周期丢失率低于5％,而在B.subtilis 168系统中则高达24％;外源基因的表达水平亦高于B.subtilis 168系统。因此,B.pumilus 289是一个值得进一步开发的基因工程受体系统。     

棘孢小单孢菌和灰色链霉菌原生质体融合的研究

用庆大霉素产生菌——棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora 814(Gm~r,Km~r)和链霉素产生菌Streptomyces griseus No. 45(Sm~r,Lm~r)进行了原生质体融合。以抗性为选择标记,选出了融合体。其融合频率在10~(-3)—10~(-4)之间。在电镜条件下,观察了原生质体融合的详细过程,测定了融合体的产抗生素能力,其中一株融合体F106的抗生素产量比亲本菌株814高58％。用羧甲基纤维素薄层对发酵液层析表明,有一个融合体的发酵液比亲本菌株814多一个组份,但没有测出其生物活性。     

提高枯草杆菌(B.subtilis)原生质体再生率的研究(简报)

细菌原生质体制备和再生是研究细胞融合的前提条件,但关于其原生质体形成及再生的最适条件迄今尚缺乏系统的研究。再生率不高,且不稳定。本文研究了有关诸因素对供试菌株原生质体化及其活性的影响,尤其是提高再生率的措施。试验所用材料,菌株B.Subtilis Ki-2-132(Thr~-,Val~-,Ile~-,Str~+)由中国科学院遗传所赠送;溶菌酶由汉口蛋厂1981     

提高枯草杆菌原生质体融合率的研究

利用改良的HM制备液,在适宜的条件下酶解制备亲本株的原生质体,在DNase存在的条件下,用PEG(MW6,000)做为聚合剂,经低温短时间处理,将枯草杆菌(B,subtilisK)Ki—2—132衍生株与BR151衍生株的原生质体融合,再在适宜的条件下使用改良的DM_3再生培养基,补加适量经处理的人血清白蛋白,同时加入适量适合于枯草杆菌细胞壁再生的引物进行再生。使再生率达到了55—58.15％左右,融合率高达1.82×10~(-2)。筛选出51种不同类型的融合子923株。经继代八代测得其融合子的稳定率达32 46％。从而在工业菌株的选育中使获得高产菌株成为可能。     

枯草杆菌质粒pUB110与大肠杆菌质粒pBR322构建的杂种质粒及其基因表型表达

用EeoRI酶消化pUB 110和pBR 322 DNA,然后以T4 DNA连接酶进行连接,转化大肠杆菌,从转化体中获得pTZ3、pTZ22和pTZ24三个杂种质粒。研究了pTZ22 DNA的分子特性,从BamHI和PstI酶切片段测出其分子量为5.6×10~6道尔顿,并确定其捻接方向。观察了三个杂种质粒的稳定性,研究了其基因表型表达。同源基因均可表达,Ap~r、TC~r基因在枯草杆菌细胞中不能进行异源表型表达,Km~r基因在大肠杆菌细胞中异源表型表达不充分。     

双功能质粒的构建与功能表达

将大肠杆菌抗四环素、氨基苄青霉素、氯霉素质粒pBR325和金黄色葡萄球菌/枯草杆菌抗新霉素、卡那霉素质粒pUB110,在体外经限制性内切酶EcoRI和T4 DNA连接酶作用,进行重组,获得了重组质粒pMM 1。pMM 1兼有抗四环素、氨基苄青霉素、卡那霉素和新霉素以及对氯霉素敏感的特性;用凝胶电泳法测定分子量,证明pMM1确为pBR325和pUB110两者的重组质粒。pMM 1在大肠杆菌中的转化频率为每微克DNA 0.79×10~3个转化子,在枯草杆菌受体中为每微克DNA 0.15×10~2个转化子。pMM1不仅能分别在大肠杆菌和枯草杆菌两种受体中复制,而且能同样表达,其抗药性水平为:对氨基苄青霉素不小于每毫升160微克,对四环素不小于每毫升120微克,对新霉素、卡那霉素不小于每毫升80微克。此外,用同样的方法构建了pBR 322和pUB 110的另一个重组质粒pMM 2,也获得了类似的结果。     

嗜热脂肪芽孢杆菌抗药性质粒的转化

从堆肥和污泥中分得8株抗药性高温细菌,经电泳检查有质粒存在,对其中1株具有卡那霉素和链霉素抗性的嗜热脂肪芽孢杆菌T617-8的质粒DNA,用电镜测得分子量为26.6×10~6道尔顿。T617-8(Km~rSm~r)菌株经溴化乙锭处理后,对卡那霉素敏感,同时质粒消失。为此确证,卡那霉素抗性是由质粒所控制。以T617-8的质粒(Km~r)DNA,对消除质粒后的菌株(Sm~r)的原生质体进行转化,获得了抗卡那霉素和链霉素的转化子。     

解淀粉芽孢杆菌赖氨酸-3基因在枯草芽孢杆菌中的克隆

限制性核酸内切酶EcoRI酶切解淀粉芽孢杆菌ASl.1099染色体DNA和质粒pUB lloDNA,T4 DNA连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BRl51(trpC2痢“B5 ly.f3 Neo')感受态细胞。用选择性培养基两次筛选,得到Neo‘和与BR 151 lys3营养缺陷突变互补的菌落。用快速测定质粒的方法检查,其中有13株转化子带有大小相同的重组质粒。分离其中l株转化子BRl51-29的重组质粒pB--L29 DNA,再次转化BRl51感受态细胞和原生质体。测定第二次得到的转化子性状,均与转化子B1~151-29相同。琼脂糖曩胶电泳检查这些转化子的质粒,其分子大小也与t组质粒pB--L29相同。以上试验证明,重组质粒pB--L29是由pUBll0和解淀粉芽孢杆蕾的咖3基因片段构成的。根据琼脂糖凝胶电泳测定pB--L29的分子量约为5.0kb,推断出l~,J3基因片段约为O.5kb。     

芽孢杆菌原生质体作为质粒DNA转化的受体

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B3F 7658,短小芽孢杆菌(B. pumilus) AS 1.940,巨大芽孢杆菌(B．Megaterium) AS 1.941,和多粘芽孢杆菌(B. polymyxa) AS 1.878等菌株,既不能作为染色体DNA的转化受体,也不能作为质粒DNA的转化受体。用不同量的溶菌酶处理这些菌株形成原生质体,然后加pUB110质粒DNA,经聚乙二醇6000(PEG)诱导,在含新霉素(400μg／ml)的DM-3再生培养基上恢复细胞壁,培养48小时后,转化子数为1.0 x 103一4.6×105／μg DNA。若同时用PEG和Ca2+ 离子诱导,转化子数可提高2—3倍。质粒pUBll0用EcoRI酶切后,转化子数大大下降(2.0×102转化子／μg DNA)。Eco RI酶切后,用T4连接酶连成环状,转化子数有所增加(1．7×103转化子／μg DNA)。     

枯草杆菌表达载体pUB23的构建及地衣杆菌α-淀粉酶基因的表达

将克隆的解淀粉芽胞杆菌强启动子经DNA序列分析后连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,构建枯草杆菌表达载体pUB23。为了测试构建的表达载体能否表达外源基因,将地衣杆菌抉失了启动子的α-淀粉酶基因接到pUB23上启动子的下游,组建重组质粒,转化枯草杆菌QB1130(amy~-),获得能分泌α-淀粉酶的转化株,证明缺失了启动子的结构基因在pUB23上克隆启动子的启动下获得表达。酶活力测定结果表明,表达水平是用原启动子时的2.5倍.     

枯草杆菌和大肠杆菌间通过原生质体融合的质粒pHV33的转移

用带有质粒pHV 33(Ap~R Tc~R Cm~R,由大肠杆菌质粒pBR 322片段和金黄色葡萄球菌质粒pC194片段联接成的嵌合质粒)的大肠杆菌SK1592和枯草杆菌FD1980(trp~- Sm~R Rif~R)作为亲本,在DNase1始终存在的条件下制备原生质体,并经PEG诱导融合,在含Sm、Rif、Cm的高渗培养基上获得融合子。融合子在菌落形态、产芽孢、染色标记等十几项特征上都和枯草杆菌亲本相同,唯一相同于大肠杆菌亲本的便是质粒pHV33的Cm~R特征。用融合子的DNA抽提物转化大肠杆菌,获得Ap~R、Tc~R、Cm~R转化子。相反方向的转移没有成功。质粒pHV33在融合子和枯草杆菌中都较不稳定。和有关文献报道一致,质粒有关的抗性Ap~R、Tc~R和Cm~R在大肠杆菌中都能表达,但是在枯草杆菌中则只有Cm~R得以表达。     

枯草芽孢杆菌中的分子克隆和单体杂种质粒转化的研究

枯草芽孢杆菌感受态细胞的质粒转化与质粒的分子构型有关。用琼脂糖凝胶电泳法分离纯化的pUB110质粒DNA单体是很少或没有转化活性的。在pUB110质粒DNA上插入一段受体菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体可以转化感受态细胞,但受体菌必须是重组型的。转化效率和插入片段的大小有关,片段愈大转化活性愈高,片段小于0.6kb,就和pUB110DNA单体一样,几乎没有转化活性。在pUB110质粒DNA上插入一段解淀粉芽孢杆菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体转化效率都很低。本文还讨论了用鸟枪法在枯草芽孢杆菌中进行分子克隆的一些问题。     

红霉素链霉菌无活性突变株原生质体融合的研究

红霉素链霉菌抗噬菌体菌株L156和生产菌株LDC2经诱变剂处理,得到了5个无活性突变株.用琼脂条法进行了共合成的互补测定,发现它们分属于3个不同类群,并初步确定了它们在红霉素合成代谢路线上发生障碍的前后顺序。我们选择了无活性突变株L156—19Em-和LDC2-4,Em-做新本,进行原生质体融合.通过溶菌酶处理时间与原生质体释放数量间关系的列比试验,不同培养基与原生质体再生频率关系的对比试验,和用琼脂块法检出融合体的试验,发现在30℃温溶中溶菌酶处理1小时即可达到最高的原生质体释放量。不同的再生培养基对于原生质体再生频率有较大影响,其中R2L培养基效果最好,其再生频率可达36％,不加特殊成份的一般斜面培养基(ZL培养基)也可以作原生质体再生,只是再生频率较低(1.2％)。用琼脂块法检出融合体是切实可行的,融合频率为1.6％。     

芽孢杆菌原生质体的形成和质粒转化的研究

测定了芽孢杆菌属中21个种、68个菌株的原生质体形成率。在高渗缓冲液(SMMP 或SMN)中,原生质体形成率在90％以上的有37株。降低高渗缓冲液中钠离子浓度,有利于原生质体的形成。用质粒(pUB 110或pC194) DNA对16株芽孢杆菌的原生质体进行了转化试验。转化成功的共8株：纳豆芽孢杆菌AS 1.107、AS 1.921、幼虫芽孢杆菌AS 1．430、球芽孢杆菌AS 1.1362、迟缓芽孢杆菌#50、苏云金芽孢杆菌松蠋亚种AS 1．294、地衣芽孢杆菌# 18和坚强芽孢杆菌#28。原生质体在DM3再生培养基上的再生率分别为0．1％一19．2％,转化效率分别为1．4×102一1．0×105转化子／μgDNA。转化效率低或未转化成功的菌株,其原生质体的再生率一般都很低或不能再生,有的菌株在形成原生质体后发生自溶。     

黑暗链霉菌DNA转移系统的建立

研究了黑暗链霉菌的基因转移系统,探索了通过PEG介导的原生质体转化、接合转移向黑暗链霉菌中转入外源DNA的可能性。多次尝试用质粒pIJ702转化黑暗链霉菌9904原生质体均未成功。对原生质体进行“热处理”后转化、利用单链DNA转化等都不能将质粒导入黑暗链霉菌中,表明黑暗链霉菌对外源DNA有很强的限制修饰作用。利用接合转移将具有oriT的大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pHZ132转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中,获得供体菌ET12567(pUZ8002,pHZ132)。将供体菌与预萌发的黑暗链霉菌9904的孢子进行接合转移,成功地将pHZ132转入黑暗链霉菌9904中。质粒pHZ132经黑暗链霉菌自身修饰后也可转入黑暗链霉菌9904菌株的原生质体中,转化率约为103/μg DNA(pHZ132)。