鱼类抗冻蛋白的研究——Ⅱ.黄盖鲽抗冻蛋白基因cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

产于我国黄海的黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)体内含有能阻止血液冰冻的抗冻肽(Antifreeze peptide AFP)。在对该蛋白进行纯化及对其特性的一系列研究的基础上,我们合成了一段抗冻肽基因的寡核苷酸片段。以此为引物,与黄盖鲽的mRNA进行杂交,从而特异性地反转录出抗冻肽基因cDNA片段。该片段经EcoRI Linker连接法克隆至大肠杆菌(E.coli)质粒载体pUC19上。抗冻肽cDNA插入片段经杂交证实后,对其进行了酶谱分析,核酸序列测定。重组克隆还在大肠杆菌JM83中得到了表达。     

几个生态因子对黄盖鲽的影响

黄盖鲽(Psuedopleuronectes yokohameGünther)是鲽科中的冷温性鱼类,广泛分布在日本、朝鲜及我国的东海、黄海和渤海。地方种群多,洄游范尉小,适应能力强,既是底栖生物食性,又可耐较低的温度,虽非名贵鱼种,却具有一定的经济价值,在开展近海增殖时,不存在越冬和效益外流问题。因此,早在60年代,日本山口县和大分县的学者们,便开始着手该品种的人工孵化和增殖放流试验。80年代初已达年放流2—3cm的稚鱼苗7.0×10~6尾的水平。为了在渤海开展增殖工作,建立综     

美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中的表达

本文报告了美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中表达的研究,以质粒P~(CT5)作为抗冻蛋白基因的供体,p~(ORF-2)作为表达载体。用HpaⅡ酶从质粒p~(CT5)上切下抗冻蛋白基因片段,再经Bal 31酶,绿豆核酸酶处理,连接上BglⅡ接头,然后插入到p~(ORF-2)的BglⅡ位点上,借助于p~(ORF-2)上的β-半乳糖苷酶基因的活性,使含正确插入抗冻蛋白基因的克隆呈现出蓝色菌落,共获得4000多个转化子,其中有201个蓝色克隆。对于50个蓝色克隆提取质粒DNA,电泳后发现均大于p~(ORF-2)。用BglⅡ消化后,可以发现有300—1500bpDNA片段,同时确定了抗冻蛋白基因在p~(ORF-2)中的插入方向,对于正确插入的克隆作出部分限制性内切酶图谱,测定出插入的抗冻蛋白基因片段的DNA序列,然后将重组质粒从E.coli MH1000菌株转化到E.coliTK1046中,研究分析表达产物,SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证明插入的抗冻蛋白的基因已表达,有明显的融合蛋白带,分子量大于β-半乳糖苷酶、是由大肠杆菌的外膜蛋白F,抗冻蛋白和β-半乳糖苷酶组成。融合蛋白含量占总蛋白的20％左右。     

美洲拟鲽抗冻蛋白基因（afp）导入番茄的研究

将整合在Ｔｉ质粒上的ａｆｐ基因供体ＤＮＡ,用花粉管通道和子房注射方法导入番 茄品种“中蔬四号”中,对Ｄ１、Ｄ２代进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得杂交带;田间抗寒性试验表明,在春季平均气温低于正常年份４．４℃条件下,转基因组植株生长势优于对照;致死温度也比对照降低２℃、说明ａｆｐ基因已整合转化番茄基因组并获得表达。     

用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化植物的问题

评估了我们用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草和国内有人用同一基因转化蕃茄的研究,提出植物耐寒性状的提高与转基因植物中抗冻蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。同时,美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害,因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

美洲鲽抗冻蛋白基因的亚克隆及构建转基因鱼的表达载体

用限制性内切酶Ｐｓｔ Ｉ部分消解含有美洲鲽抗冻蛋白基因的ｐＣＴ５质粒,分离得到３２４ｂｐ的片段,将此片段亚克隆到ｐＵＣ１９质粒中,筛选到ｐＵＣ－ＡＦ重组子。从ｐＵＣ－ＡＦ重组子中,用ＢａｍＨＩ和ＨｉｒｄⅢ切下３２４ｂｐ的抗冻蛋白基因,再重组到含有ＳＶ４０病毒启动子的ｐＫＳＶ－１０的载体中,构建成转基因鱼的表达载体,此表达载何可用于鱼的基因转移的研究。     

黄盖鲽抗冻蛋白的分离与cDNA克隆

五十年代末,六十年代初,国外学者从极地鱼类中发现并分离出能使血液冰点降低的抗冻物质。这种物质分为糖蛋白及抗冻肽两类。人们以美洲拟鲽(Pseudopleuronecics americanus)等为材料,对抗冻肽的性质、一级结构、mRNA,基因表达等都进行了研究。有关抗冻肽的作用机理以及基因的表达调节都是学者注意的中心。对抗冻蛋白基因的研究,在理论上可以使人们了解鱼类血清冰点降低的遗传基础,研究基因     

转美洲拟鲽抗冻蛋白基因（AFP）番茄的叶片电导率测定

对转美州拟鲽抗冻蛋白基因（ＡＦＰ）的第三代（Ｄ３）番茄及其对照,经低温处理后进行幼苗叶片组织电导率测定,发现转基因各组电导率均比对照明显降低,说明导入的ＡＦＰ基因已经表达并使番茄获得抗寒性。     

转美州拟鲽抗冻蛋白基因(AFP)番茄的叶片电导率测定

对转美州拟鲽抗冻蛋白基因（ADP）的第三代（D3）番茄及其对照,经低温处理后进行幼苗叶片组织电导率测定,发现转基因各组电导率均比对照明显降低,说明导入的AFP基因已经表达并使番茄获得抗寒性。     

美洲拟鲽抗冻蛋白基因(afp)导入番茄的研究

将整合在Ｔｉ质粒上的ａｆｐ基因作为供体ＤＮＡ,用花粉管通道和子房注射方法导入番茄品种“中蔬四号”中,对Ｄ１、Ｄ２代进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得杂交带;田间抗寒性试验表明,在春季平均气温低于正常年份４·４℃条件下,转基因组植株生长势优于对照;致死温度也比对照降低２℃．说明ａｆｐ基因已整合到转化番茄基因组并获得表达     

昆虫抗冻蛋白的分离纯化及特性分析

昆虫抗冻蛋白具有很高的热滞活性,可保护机体免受结冰引起的伤害。昆虫抗冻蛋白的分离纯化多采用凝胶过滤层析、离子交换层析及HPLC等技术,已用于鱼类抗冻蛋白纯化的冰亲和纯化(IAP)技术也可考虑应用于昆虫抗冻蛋白的分离提纯。昆虫抗冻蛋白具有高活性,规则的一级结构及类似的冰晶结合表面等特性。     

鱼类抗冻蛋白的研究进展

抗冻蛋白 (AFP)可非依数性地降低溶液冰点 ,对冷冻细胞和胚胎具有高效的保护作用。目前的研究表明 ,不同的鱼类抗冻蛋白尽管都具有降低冰点的活性 ,但在结构和组成上又存在有较大的差异。根据其结构和化学组成 ,一般将它们分为 4大类 :AFP I、AFP II、AFP III和AFP IV。抗冻蛋白的编码基因为基因组中多拷贝基因家族的成员 ,其基因表达在很大程度上要受到季节变化的影响。目前 ,普遍使用吸附抑制假说来解释AFP非依数性降低溶液冰点的分子机制 ,但不同类抗冻蛋白在降低溶液冰点时的作用模式却不尽相同。现就鱼类的 4类抗冻蛋白的结构组成、基因性质、抗冻机制及其在细胞和胚胎冻存中的作用等领域的研究进展进行概括性综述     

抗冻蛋白基因结构与基因工程

鱼类抗冻蛋白有四种类型。Ⅰ型抗冻蛋白(AFP),富丙氨酸,如北美黄盖鲽AFP(Davies等1985,Scott等1985),Ⅱ型,富半胱氨酸,如海渡鸦AFP(Hayes等1989);     

美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化番茄的形态学与苹果酸脱氢酶同工酶检测

将带有afp基因的Ti质粒pMon(232),作为供体DNA,用花柱道和子房注射DNA的方法转化番茄品种“中蔬四号”对D1D2代进行田间抗寒性观察,发现在春季平均气温低于正常年分4．4℃条件下,有些组分田间长势明显好于对照。初步确认已获得抗寒性。对D2代转基因植株进行MDH同工酶分析,均与对照有明显差异,间接验证了外源DNA的导入,说明同工酶分析,可作为转基因植株早期筛选的生化指标。     

用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化植物的问题

评估了我们用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草和国内有人用同一基因转化蕃茄的研究 ,提出植物耐寒性状的提高与转基因植物中抗冻蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。同时 ,美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害 ,因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

昆虫抗冻蛋白的结构与生物学特性研究

抗冻蛋白(antifreeze proteins AFPs)是一类抑制冰晶生长的蛋白质,它能以非依数性形式降低溶液的冰点而对其熔点影响甚微,因而也被称作热滞蛋白。近几年来对于昆虫抗冻蛋白的研究取得了较快的发展,已有20多种昆虫抗冻蛋白被分离纯化。就昆虫抗冻蛋白的结构特征、生物学特性以及在农业、医学和食品工业等方面的应用进行介绍。     

一种女贞叶抗冻蛋白的分离纯化

根据抗冻蛋白与冰结合的特性,利用碎冰从女贞(Ligustrum lucidum)叶提取液中分离出抗冻蛋白。结果表明,通过碎冰吸附、凝胶过滤和离子交换层析可以获得4个组分的蛋白质,其中的1个经鉴定具有热滞活性。在蛋白质浓度为5mg.mL-1时,它的热滞活性(thermal hysteresis activity,THA)值为0.678°C,对其进行全波长扫描(200-1000nm)发现在975nm处有吸收峰;该蛋白亲水性氨基酸含量较高。     

一种女贞叶抗冻蛋白的分离纯化

根据抗冻蛋白与冰结合的特性, 利用碎冰从女贞(Ligustrum lucidum)叶提取液中分离出抗冻蛋白。结果表明, 通过碎冰吸附、凝胶过滤和离子交换层析可以获得4个组分的蛋白质, 其中的1个经鉴定具有热滞活性。在蛋白质浓度为5 mg. mL-1时, 它的热滞活性(thermal hysteresis activity, THA)值为0.678°C, 对其进行全波长扫描(200-1 000 nm)发现在975nm处有吸收峰; 该蛋白亲水性氨基酸含量较高。