抗人活化血小板单抗SZ一51嵌合抗体的构建及表达

ＳＺ－５１是一种抗人活化血小板单克隆抗体,并显示了很好的导向血栓显像与导向溶栓性能。为了减少该单抗的免疫原性以及能获得高效表达的ＳＺ－５１“人源化”单抗,我们构建了真核表达载体ａ－Ｌｙｓ１７－５１ＶＫ／Ｈｕ．ａ－Ｌｙｓ３０－５１ＶＨ／Ｈｕ。应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法分别将重、轻链表达载体导入骨髓瘤细胞ＳＰ２／０中,并在相应的选择性培养基中进行耐药克隆筛选,经过体外长期传代培养和二次单克隆化,获得了一株高效表达重组ＳＺ－５１嵌合抗体的细胞株。培养上清中抗体蛋白的表达量为５ｍｇ／Ｌ,经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实重组嵌合抗体具有与亲本鼠源单抗相同的ＧＭＰ－１４０结合特性,而且能与鼠源ＳＺ－５１单抗竞争结合活化血小板。本研究结果表明,基因工程“人源化”ＳＺ－５１单抗可以作为导向载体进行导向显像与导向溶栓,并为今后进一步应用于临床展示了良好的前景。     

重组抗体—尿激酶导向溶栓剂的基因构建及表达

为了获得高效、高特异性溶栓药物,应用基因工程技术,成功的表达了由人源化抗人活化血小板单抗和单链尿酶组成的抗体导向溶栓剂（ＳＺ５１Ｈｕ－ｓｃｕＰＡ）。通过基因重组ＰＣＲ方法将ｓｃｕＰＡ全长ｃＤＮＡ的Ｎ末端连接在ＳＺ５１重链恒区ＣＨ３末端,构建了含有目的蛋白融合基因的真核表达载体αｌｙｓ３０－ＳＺ５１ＶＨ／Ｈｕ－ｓｃｕＰＡ。采用脂转染法将表达载体导入分泌ＳＺ５１ＶＫ／Ｈｕ轻链的小鼠骨髓瘤细胞中,筛选出     

一种新型人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达

采用多位点突变引物和ＰＣＲ方法对合成的人肿瘤坏死因子进行了突变,通过这一突变,人肿瘤坏死因子的第二位精氨酸的密码子ＣＧＴ被变为赖氨酸密码子ＡＡＡ,将突变后的基因插入表达载体ｐＳＢ－９２的ＰＬ启动子下游得到重组质粒ｐＳＢ－ＴＮＦ－Ｋ２,并在大肠杆菌中进行表达。突变体［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α的表达产率达到菌体内总蛋白质的６０％以上,且为一可溶性蛋白质并易于纯化。同野生型ｈＴＮＦ－α相比,［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α具有稍低的毒性,但对于某些人肿瘤细胞株表现出高于数十到数百倍的抑制活性．     

人促红细胞生成素基因组基因和cDNA的克隆及其在COS－7细胞中的表达

利用ＰＣＲ技术,从正常人胎肝染色体ＤＮＡ中克隆到长度为１５７２ｂｐ的人促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因片段,它包含除第一个外显子和第一个内含子外所有外显子及内含子。再人工合成１３ｂｐ外显子１的编码区,并与１５７２ｂｐ片段拼接,从而得到除第一个内含子的人促红细胞生成素基因组基因。将克隆得到的ＥＰＯ基因插入载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ得到ｐＳＶ２－ＥＰＯ表达载体,转染ＣＯＳ－７细胞后获得高效表达。利用自行研制的小鼠抗人ＥＰＯ单抗及兔抗人ＥＰＯ多抗,对表达产物进行ＥＬＩＳＡ定量测定,细胞分泌ＥＰＯ量高达２５１±７Ｕ／ｍｌ．Ｋｒｙｓｔａｌ法测得体外生物活性２４１．５±６．５Ｕ／ｍｌ．用ＥＰＯ单抗免疫沉淀结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对转染细胞的表达产物做了进一步鉴定,清晰地看到了ＥＰＯ条带。从高效表达ＥＰＯ的转染细胞中分离纯化ｍＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆到ＥＰＯ的ｃＤＮＡ,这为ＥＰＯ在其它系统中的表达及ＥＰＯ的功能与结构的研究打下了基础。     

抗结肠癌相关抗原单链抗基因的构建和表达

通过ＰＣＲ扩增和酶切分别得到抗结肠癌相关抗原抗体的重链可变区序列,轻链可变区序列及连接肽序列,将它们构建成为ＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ形式的单链抗体基因片段,并在大肠杆菌中进行了表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明,以ｐＣｏｍｂ３为载体,在大肠杆菌ＪＭ８３中,ｓｃＦｖ未获得有效表达,而以ｐＥＴ－２２ｂ（＋）为载体的ｓｃＦｖ在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,３０℃诱导培养获得了高效表达,表达水平占全菌蛋白     

HCV/HBV复合抗原基因的克隆、表达及免疫应答研究

为探讨ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合疫苗的可行性,将合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）复合多表位抗原基因ＰＣＸ与ＨＢｓＡｇ 基因连接成ＰＣＸＳ基因,与β－半乳糖苷酶（ＧＺ）基因融合后在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得表达．目的蛋白ＧＺ－ＰＣＸＳ可被抗－ＨＢｓ 及抗－ＨＣＶ 抗体所特异识别．ＧＺ－ＰＣＸＳ抗原皮下注射免疫ＩＣＲ小鼠后,诱发了较高水平的抗－ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲ／ＰＣＸＳ）口服免疫小鼠后,诱发了高水平的ＣＤ８＋ Ｔ细胞增殖反应及抗ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．所有免疫小鼠均未见明显的毒副作用．该研究揭示,ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合抗原可诱发特异性体液免疫及细胞免疫应答,而活菌苗口服可能是理想的免疫途径,为ＨＣＶ／ＨＢＶ 双价疫苗研究提供了一定的理论及实验依据．     

单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒载体的构建及LacZ基因的表达

从单纯疱疹病毒Ⅰ型ＨＳＶ－１基因组中分离出其包装信号序列,与含ＨＳＶ－１复制起点及ＩＥ－６８基因启动子的ＤＮＡ序列、β半乳糖苷酶基因和大肠杆菌质粒骨架,构建了一种ＨＳＶ－１扩增子质粒载体ｐＨＳＬ,其中ＬａｃＺ基因置于ＩＥ－６８基因启动子控制下。将此质粒转染已感染了ＨＳＶ－１温度敏感株ｔｓＫ株的Ｖｅｒｏ细胞,ｐＨＳＬ可在ＨＳＶ－１ｔｓＫ的辅助下包装成假病毒颗粒,这样就可得到同时含有假病毒和ＨＳＶ－１ｔｓＫ的混合毒株ｄｖＨＳＬ。将此混合毒株感染传代细胞和神经细胞,可在其中表达ＬａｃＺ基因,而在生理温度（３７℃）下,混合毒株的复制受到抑制。提示这种缺陷型疱疹病毒载体有用于向神经系统基因转移的可能性。     

金属硫蛋白与单抗SZ51重组蛋白在大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中表达的研究

从基因工程水平构建了小鼠金属硫蛋白与抗人活化血小板单抗ＳＺ５１单链抗体的重组基因产物,并在大肠杆菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中成功地进行了表达．该重组蛋白以包涵体形式存在于菌体蛋白中,分子量为３８ｋＤ,ＥＬＩＳＡ实验证明该重组蛋白既具有血栓部位活化血小板的单抗活性,又具有小鼠ＭＴ单抗的活性     

BIV—1—gp120在重组杆状病毒系统中的表达

将中国株ＨＩＶ－１Ｂ亚型ｇｐ１２０全基因序列克隆到杆状病毒转座载体ｐＦａｓｔＢａｃＩ中多角体启动子下游,构建成重组转座载体ｐＦａｓｔＢａｃＩ－ｇｐ１２０,利用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ）表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞Ｓｆ９中高效表达了ＨＩＶ－１的外膜糖蛋白ｇｐ１２０,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果一致,证明表达了２种糖基化程度不同的ｇｐ１２０。     

Epstein-Barr病毒BNLF-1基因的克隆及其在PA317细胞中的表达

本文报道以人Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒的潜伏膜蛋白基因ＢＮＬＦ－１作为目标基因,插入至逆转录病毒载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）－ＬＭＰ及其反义载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）－ａｎｔｉ－ＬＭＰ,通过质粒ＤＮＡ的电转染和Ｇ４１８培养基筛选,然后对１０个抗性克隆进行基因整合分析,获得６个含ＭＬＶ－ＬＴＲ／ＢＮＬＦ－１融合基因的阳性克隆,采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明,在克隆细胞中表达了２．６ｋｂ的ｍＲＮＡ片段及相应的蛋白质分子,这是由ＢＮＬＦ－１基因的ＥＤＬ１启动子表达的产物。     

抗乙肝病毒表面抗原嵌合抗体基因在昆虫细胞中的表达

应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）人－鼠嵌合抗体重,轻链基因,鼠源单克隆抗体ＯＨ３重,轻链可变区（ＶＨ,ＶＬ）ｃＤＮＡ分别与人免疫球蛋白恒区γ３,ｋ,ｃＤＮＡ拼接成人－鼠嵌合抗体基因,含嵌合抗体的转移载体与线性化病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,并通过点杂交ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析获得重组病毒。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和竞争ＥＬＩＳＡ表明以重组病毒感染的     

重组人GM—CSF基因在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）带β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基因标记的非融合蛋白基因转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃ将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）基因成功地插入病毒ＡｃＮＰＶ的基因组中．ｈＧＭ－ＣＳＦ基因在感染重组病毒的草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）培养细胞Ｓｆ９中得到表达,感染后的Ｓｆ９细胞培养液能刺激人骨髓细胞在体外形成典型的集落,表达水平可达２．７×１０５５ＣＦＵ／ｍｌ。以ｈＧＭ－ＣＳＦ单抗所作的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ表明,表达的ｈＧＭ－ＣＳＦ对是３种糖基化程度不同的产物,分子量分别约为１５ｋｄ,１８ｋｄ和２０ｋｄ。     

HIV—1Gag蛋白在大肠杆菌和重组杆状病毒系统中的高效表达及通用型 …

将中国株ＨＩＶ－１Ｂ亚型ｇａｇ全基因序列,克隆杆状病毒表达载体ｐｆａｓｔｂａｃＩ中,构建了重组质粒ｐｆａｓｔＧａｇ,利用细菌／杆状病毒表达和筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞中高效表达ＨＩＶ－１Ｇａｇ蛋白。通过改造原核表达载体ｐＢＶ２２０和ｐＥＴ２８,构建了一种新的通用型温控原核表达载体质粒ｐＶＶ５,该载体携带ＰｒＰｌ串联温控启动子及Ｈｉｓ－Ｔａｇ纯化标签,利于目的的蛋白表达与纯化。     

单纯疱疹病毒I型扩增子系列载体的构建

我们先前已报道了构建成一种能在ＨＳＶ ｔｓＫ株辅助下进行复制和包装,并表达β－半乳糖苷酶基因ｌａｃＺ的ＨＳＶ－１扩增子质粒ｐＨＳＬ,以及它的应用。该质料中依次含有ＨＳＶ－１复制起点ｏｒｉＳ序列及ＩＥ６８启动子、ｌａｃＺ基因、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＨＳＶ－１包装信号‘ａ’序列和大肠杆菌质粒骨架。然而,该质粒中的报告基因ｌａｃＺ无法用简单的酶切方法卸载下来,继而装入目的基因。本研究在此基础上,新构建了一     

天花粉蛋白Lys和Arg残基的化学修饰对其与IgE反应…

用马来酸酐及环己二酮分别对天花粉蛋白上的Ｌｙｓ,Ａｒｇ残基侧链进行修饰,并以竞争性酶免疫测定检查了化学修饰对ＴＣＳ与小鼠抗ＴＣＳ单抗ＴＥ－１（ＩｇＥ）反应活性的影响。两种修饰均使ＴＣＳ与单抗ＴＥ－１反活性下降,推测Ｌｙｓ残基可能直接参了与单抗ＴＥ－１的结合,热变性实验提示ＴＣＳ上单抗ＴＥ－１识别部位需要一定的空间构象。     

天花粉蛋白Lys和Arg残基的化学修饰对其与IgE反应活性的影响

用马来酸酐及环己二酮分别对天花粉蛋白上的Ｌｙｓ、Ａｒｇ残基侧链进行修饰,并以竞争性酶免疫测定检查了化学修饰对ＴＣＳ与小鼠抗ＴＣＳ单抗ＴＥ－１（ＩｇＥ型）反应活性的影响。两种修饰均使ＴＣＳ与单抗ＴＥ－１反应活性下降。推测Ｌｙｓ残基可能直接参予了与单抗ＴＥ－１的结合。热变性实验提示ＴＣＳ上单抗ＴＥ－１识别部位需要一定的空间构象。     

猪脑抗吗啡镇痛肽的分离纯化及其抗血清对吗啡耐受影响的初步…

猪脑组织提取液经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０分子筛层析,Ｓ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ阳离子交换柱层析及两次ＨＰＬＣ分离得到一分子量为１２０００,等电点ＰＩ７．１的多肽,并测定了其氨基酸组成和Ｎ末端部分序列：Ｎ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ａｓｐ／（Ｌｙｓ）－Ｌｙｓ／（Ａｓｐ）－Ａｓｐ－Ｔｙｒ,给昆明小鼠脑室注射或尾静脉注射肽均能抑制吗啡引起的镇痛作用,其作用随着注射剂量的     

汉滩病毒核壳蛋白（NP）在杆状病毒系统的表达及其免疫原性研究

应用杆状病毒表达载体成功地表达了汉滩病毒７６－１１８株（ＨＴＮＶ）核壳蛋白,将ＨＴＮＶＳ基因插入杆状病毒转染质粒ｐＡｃＹＭＩＢ的多角体基因启动子下游附近,与经Ｂｓｕ３６１酶切线性化的杆状病毒（ＡｃＶＥＰＡ）ＤＮＡ共同转染Ｓ１９细胞,经空斑筛选获得了高效表达ＮＰ的重组杆状病毒（ＡｃＶＨａｎＳ）。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实,表达产物与ＨＴＮＶ毒粒ＮＰ分子量均为５０ＫＤ左右,紫外扫     

人表皮生长因子（EGF）与单核—巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）融合？…

应用基因工程技术,将ＥＧＦ,ＧＭ－ＣＳＦ基因克隆到ｐＧＥＭ－３Ｚｆ载体的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,再钭重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０扔ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达,ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明ＥＧ－ＦＧＭ－ＣＳＦ融全蛋白获得表达,并且具有ＥＧＦ,ＧＭ－ＣＳＦ免疫学活活。     

缩短的人巨噬细胞集落刺激因子（M—CSF）在大肠杆菌中…

本文用聚合酶链反应（ＰＣＲ）获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子ｃＤＮＡ基因,并克隆在质粒ｐＡＥＴ３ｄ中,在Ｔ７启动子指导下,在大肠杆菌ＢＬ２ＬｙｓＥ中获得了和一个６组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合Ｍ－ＣＳＦ表达量占菌体总蛋白的１２％,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螯合新和层析一步纯化,所得的融合（Ｈｉｓ）６－Ｍ－ＣＳＦ在还原型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上基