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1.
SZ-51是一种抗人活化血小板单克隆抗体,并显示了很好的导向血栓显像与导向溶栓性能。为了减少该单抗的免疫原性以及能获得高效表达的SZ-51“人源化”单抗,我们构建了真核表达载体a-Lys17-51VK/Hu.a-Lys30-51VH/Hu。应用Lipofectin方法分别将重、轻链表达载体导入骨髓瘤细胞SP2/0中,并在相应的选择性培养基中进行耐药克隆筛选,经过体外长期传代培养和二次单克隆化,获得了一株高效表达重组SZ-51嵌合抗体的细胞株。培养上清中抗体蛋白的表达量为5mg/L,经Westernblot证实重组嵌合抗体具有与亲本鼠源单抗相同的GMP-140结合特性,而且能与鼠源SZ-51单抗竞争结合活化血小板。本研究结果表明,基因工程“人源化”SZ-51单抗可以作为导向载体进行导向显像与导向溶栓,并为今后进一步应用于临床展示了良好的前景。 相似文献
2.
重组抗体—尿激酶导向溶栓剂的基因构建及表达 总被引:5,自引:0,他引:5
为了获得高效、高特异性溶栓药物,应用基因工程技术,成功的表达了由人源化抗人活化血小板单抗和单链尿酶组成的抗体导向溶栓剂(SZ51Hu-scuPA)。通过基因重组PCR方法将scuPA全长cDNA的N末端连接在SZ51重链恒区CH3末端,构建了含有目的蛋白融合基因的真核表达载体αlys30-SZ51VH/Hu-scuPA。采用脂转染法将表达载体导入分泌SZ51VK/Hu轻链的小鼠骨髓瘤细胞中,筛选出 相似文献
3.
一种新型人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达 总被引:8,自引:2,他引:8
采用多位点突变引物和PCR方法对合成的人肿瘤坏死因子进行了突变,通过这一突变,人肿瘤坏死因子的第二位精氨酸的密码子CGT被变为赖氨酸密码子AAA,将突变后的基因插入表达载体pSB-92的PL启动子下游得到重组质粒pSB-TNF-K2,并在大肠杆菌中进行表达。突变体[Lys2]hTNF-α的表达产率达到菌体内总蛋白质的60%以上,且为一可溶性蛋白质并易于纯化。同野生型hTNF-α相比,[Lys2]hTNF-α具有稍低的毒性,但对于某些人肿瘤细胞株表现出高于数十到数百倍的抑制活性. 相似文献
4.
利用PCR技术,从正常人胎肝染色体DNA中克隆到长度为1572bp的人促红细胞生成素(EPO)基因组基因片段,它包含除第一个外显子和第一个内含子外所有外显子及内含子。再人工合成13bp外显子1的编码区,并与1572bp片段拼接,从而得到除第一个内含子的人促红细胞生成素基因组基因。将克隆得到的EPO基因插入载体pSV2-dhfr得到pSV2-EPO表达载体,转染COS-7细胞后获得高效表达。利用自行研制的小鼠抗人EPO单抗及兔抗人EPO多抗,对表达产物进行ELISA定量测定,细胞分泌EPO量高达251±7U/ml.Krystal法测得体外生物活性241.5±6.5U/ml.用EPO单抗免疫沉淀结合SDS-PAGE对转染细胞的表达产物做了进一步鉴定,清晰地看到了EPO条带。从高效表达EPO的转染细胞中分离纯化mRNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到EPO的cDNA,这为EPO在其它系统中的表达及EPO的功能与结构的研究打下了基础。 相似文献
5.
抗结肠癌相关抗原单链抗基因的构建和表达 总被引:3,自引:2,他引:1
通过PCR扩增和酶切分别得到抗结肠癌相关抗原抗体的重链可变区序列,轻链可变区序列及连接肽序列,将它们构建成为VH-linker-VL形式的单链抗体基因片段,并在大肠杆菌中进行了表达,SDS-PAGE分析结果表明,以pComb3为载体,在大肠杆菌JM83中,scFv未获得有效表达,而以pET-22b(+)为载体的scFv在大肠杆菌BL21(DE3)中,30℃诱导培养获得了高效表达,表达水平占全菌蛋白 相似文献
6.
为探讨HCV/HBV 复合疫苗的可行性,将合成的丙型肝炎病毒(HCV)复合多表位抗原基因PCX与HBsAg 基因连接成PCXS基因,与β-半乳糖苷酶(GZ)基因融合后在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得表达.目的蛋白GZ-PCXS可被抗-HBs 及抗-HCV 抗体所特异识别.GZ-PCXS抗原皮下注射免疫ICR小鼠后,诱发了较高水平的抗-GZ-PCXSIgG反应.构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261(pWR/PCXS)口服免疫小鼠后,诱发了高水平的CD8+ T细胞增殖反应及抗GZ-PCXSIgG反应.所有免疫小鼠均未见明显的毒副作用.该研究揭示,HCV/HBV 复合抗原可诱发特异性体液免疫及细胞免疫应答,而活菌苗口服可能是理想的免疫途径,为HCV/HBV 双价疫苗研究提供了一定的理论及实验依据. 相似文献
7.
单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒载体的构建及LacZ基因的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
从单纯疱疹病毒Ⅰ型HSV-1基因组中分离出其包装信号序列,与含HSV-1复制起点及IE-68基因启动子的DNA序列、β半乳糖苷酶基因和大肠杆菌质粒骨架,构建了一种HSV-1扩增子质粒载体pHSL,其中LacZ基因置于IE-68基因启动子控制下。将此质粒转染已感染了HSV-1温度敏感株tsK株的Vero细胞,pHSL可在HSV-1tsK的辅助下包装成假病毒颗粒,这样就可得到同时含有假病毒和HSV-1tsK的混合毒株dvHSL。将此混合毒株感染传代细胞和神经细胞,可在其中表达LacZ基因,而在生理温度(37℃)下,混合毒株的复制受到抑制。提示这种缺陷型疱疹病毒载体有用于向神经系统基因转移的可能性。 相似文献
8.
从基因工程水平构建了小鼠金属硫蛋白与抗人活化血小板单抗SZ51单链抗体的重组基因产物,并在大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中成功地进行了表达.该重组蛋白以包涵体形式存在于菌体蛋白中,分子量为38kD,ELISA实验证明该重组蛋白既具有血栓部位活化血小板的单抗活性,又具有小鼠MT单抗的活性 相似文献
9.
将中国株HIV-1B亚型gp120全基因序列克隆到杆状病毒转座载体pFastBacI中多角体启动子下游,构建成重组转座载体pFastBacI-gp120,利用细菌/杆状病毒(Bac to Bac)表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞Sf9中高效表达了HIV-1的外膜糖蛋白gp120,SDS-PAGE和Western blot分析结果一致,证明表达了2种糖基化程度不同的gp120。 相似文献
10.
本文报道以人Epstein-Barr病毒的潜伏膜蛋白基因BNLF-1作为目标基因,插入至逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)-LMP及其反义载体pZipNeoSV(x)-anti-LMP,通过质粒DNA的电转染和G418培养基筛选,然后对10个抗性克隆进行基因整合分析,获得6个含MLV-LTR/BNLF-1融合基因的阳性克隆,采用Northern杂交及Western印迹证明,在克隆细胞中表达了2.6kb的mRNA片段及相应的蛋白质分子,这是由BNLF-1基因的EDL1启动子表达的产物。 相似文献
11.
抗乙肝病毒表面抗原嵌合抗体基因在昆虫细胞中的表达 总被引:1,自引:1,他引:1
应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)人-鼠嵌合抗体重,轻链基因,鼠源单克隆抗体OH3重,轻链可变区(VH,VL)cDNA分别与人免疫球蛋白恒区γ3,k,cDNA拼接成人-鼠嵌合抗体基因,含嵌合抗体的转移载体与线性化病毒DNA共转染Sf9细胞,并通过点杂交PCR扩增和Southernblot分析获得重组病毒。Westernblot和竞争ELISA表明以重组病毒感染的 相似文献
12.
重组人GM—CSF基因在昆虫细胞中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)带β-Galactosidase基因标记的非融合蛋白基因转移载体pBlueBac将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因成功地插入病毒AcNPV的基因组中.hGM-CSF基因在感染重组病毒的草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)培养细胞Sf9中得到表达,感染后的Sf9细胞培养液能刺激人骨髓细胞在体外形成典型的集落,表达水平可达2.7×1055CFU/ml。以hGM-CSF单抗所作的WesternBlotting表明,表达的hGM-CSF对是3种糖基化程度不同的产物,分子量分别约为15kd,18kd和20kd。 相似文献
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HIV—1Gag蛋白在大肠杆菌和重组杆状病毒系统中的高效表达及通用型 … 总被引:1,自引:0,他引:1
将中国株HIV-1B亚型gag全基因序列,克隆杆状病毒表达载体pfastbacI中,构建了重组质粒pfastGag,利用细菌/杆状病毒表达和筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞中高效表达HIV-1Gag蛋白。通过改造原核表达载体pBV220和pET28,构建了一种新的通用型温控原核表达载体质粒pVV5,该载体携带PrPl串联温控启动子及His-Tag纯化标签,利于目的的蛋白表达与纯化。 相似文献
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单纯疱疹病毒I型扩增子系列载体的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
我们先前已报道了构建成一种能在HSV tsK株辅助下进行复制和包装,并表达β-半乳糖苷酶基因lacZ的HSV-1扩增子质粒pHSL,以及它的应用。该质料中依次含有HSV-1复制起点oriS序列及IE68启动子、lacZ基因、SV40polyA、HSV-1包装信号‘a’序列和大肠杆菌质粒骨架。然而,该质粒中的报告基因lacZ无法用简单的酶切方法卸载下来,继而装入目的基因。本研究在此基础上,新构建了一 相似文献
15.
用马来酸酐及环己二酮分别对天花粉蛋白上的Lys,Arg残基侧链进行修饰,并以竞争性酶免疫测定检查了化学修饰对TCS与小鼠抗TCS单抗TE-1(IgE)反应活性的影响。两种修饰均使TCS与单抗TE-1反活性下降,推测Lys残基可能直接参了与单抗TE-1的结合,热变性实验提示TCS上单抗TE-1识别部位需要一定的空间构象。 相似文献
16.
天花粉蛋白Lys和Arg残基的化学修饰对其与IgE反应活性的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
用马来酸酐及环己二酮分别对天花粉蛋白上的Lys、Arg残基侧链进行修饰,并以竞争性酶免疫测定检查了化学修饰对TCS与小鼠抗TCS单抗TE-1(IgE型)反应活性的影响。两种修饰均使TCS与单抗TE-1反应活性下降。推测Lys残基可能直接参予了与单抗TE-1的结合。热变性实验提示TCS上单抗TE-1识别部位需要一定的空间构象。 相似文献
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猪脑组织提取液经SephadexG-50分子筛层析,S-SepharoseFastFlow阳离子交换柱层析及两次HPLC分离得到一分子量为12000,等电点PI7.1的多肽,并测定了其氨基酸组成和N末端部分序列:N-Phe-Lys-Gly-Phe-Pro-Asp-Asp/(Lys)-Lys/(Asp)-Asp-Tyr,给昆明小鼠脑室注射或尾静脉注射肽均能抑制吗啡引起的镇痛作用,其作用随着注射剂量的 相似文献
18.
汉滩病毒核壳蛋白(NP)在杆状病毒系统的表达及其免疫原性研究 总被引:11,自引:0,他引:11
应用杆状病毒表达载体成功地表达了汉滩病毒76-118株(HTNV)核壳蛋白,将HTNVS基因插入杆状病毒转染质粒pAcYMIB的多角体基因启动子下游附近,与经Bsu361酶切线性化的杆状病毒(AcVEPA)DNA共同转染S19细胞,经空斑筛选获得了高效表达NP的重组杆状病毒(AcVHanS)。经SDS-PAGE和Western blot证实,表达产物与HTNV毒粒NP分子量均为50KD左右,紫外扫 相似文献
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人表皮生长因子(EGF)与单核—巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)融合?… 总被引:1,自引:0,他引:1
应用基因工程技术,将EGF,GM-CSF基因克隆到pGEM-3Zf载体的EcoRI,BamHI位点上,再钭重组融合基因亚克隆到表达载体pBV220扔EcoRI,BamHI位点上,在大肠杆菌DH5α中进行表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot表明EG-FGM-CSF融全蛋白获得表达,并且具有EGF,GM-CSF免疫学活活。 相似文献
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缩短的人巨噬细胞集落刺激因子(M—CSF)在大肠杆菌中… 总被引:1,自引:1,他引:0
本文用聚合酶链反应(PCR)获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子cDNA基因,并克隆在质粒pAET3d中,在T7启动子指导下,在大肠杆菌BL2LysE中获得了和一个6组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合M-CSF表达量占菌体总蛋白的12%,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螯合新和层析一步纯化,所得的融合(His)6-M-CSF在还原型SDS-PAGE上基 相似文献