G138P定点突变对葡萄糖异构酶热稳定性的改善

通过分子设计,确定Ｇｌｙ１３８为改善葡萄糖异构酶（ＧＩ）热稳定性的目标氨基酸。用双引物法对ＧＩ基因进行体外定点突变,构建了ＧＩ突变体Ｇ１３８Ｐ。含突变体的重组质粒ｐＴＫＤ－ＧＩＧ１３８Ｐ在Ｅ．ｃｏｌｉＫ３８菌株中表达。ＧＩＧ１３８Ｐ与野生型ＧＩ比较实验表明：（１）ＧＩＧ１３８Ｐ的热失活半衰期约是野生型ＧＩ的２倍;（２）ＧＩＧ１３８Ｐ的最适反应温度提高了１０￣１２℃;（３）ＧＩＧ１３８Ｐ的比活与野生     

葡萄糖异构酶的生物工程研究进展

D-葡萄糖异构酶(GI)能分别催化D-葡萄糖和D-木糖异构为D-果糖和D-木酮糖. 它是工业上生产高果糖浆的关键酶. 在GI负氢离子转移机制中,其主要特征是底物的开环、通过C₂至C₁间负氢离子转移的GI异构化作用、以及产物的闭环. GI基因已在同源、异源宿主中获得克隆、测序和超量表达. 经过蛋白质工程改造的GI将是未来最重要的工业用酶之一.     

用蛋白质工程方法改变葡萄糖异构酶最适pH和最适温度

用寡核苷酸诱导的定点突变方法构建了葡萄糖异构酶基因的突变体（Ｎ１８４Ｄ和Ａ１９８Ｃ）。含突变体的重组质粒ｐＴＫＤ－ＧＩ１（Ｎ１８４Ｄ）和ｐＴＫＤ－ＧＩ２（Ａ１９８ｃ）在Ｅ．ｃｏｌｉＫ３８菌株中表达,用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ和Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ＨＲ柱层析分离纯化突变酶。与野生型葡萄糖异构酶比较实验表明：（１）突变酶Ｎ１８４Ｄ的最适ｐＨ值下降了１个单位;等电点下降了０．６个单位     

Q20L及G247D定点突变对葡萄糖异构酶酶活和最适pH的改善

用双引物法对GI基因进行体外定点突变,构建了突变体Q20L和G247D。含突变基因的重组表达质粒pTKD-GIQ20L及pTKDGIG247D在E.coli K38菌株中表达。纯化的突变酶与野生型酶相比：(1) GIQ20L的最适反应温度下降5℃,热稳定性为野生型酶的78%,对底物的亲和性增强;(2) GIG247D的酶活提高约33%,最适pH下降0.6个单位,但热稳定性降低。初步分析认为,Gln 20位于α0～α1螺旋之间,其亲水侧链被Leu的疏水侧链取代后,分子表面增强的疏水作用,反而不利于蛋白质的稳定,使GIQ20L的热稳定性降低。Gly247是酶活性中心β折叠(242～247aa)的最后一个残基。引入电负性极强的Asp后,可能改变分子的静电场分布,影响了活性部位的电荷传递过程,使GIG247D酶活提高。引入的电荷,可能改变活性中心可解离基团的pKa,使其最适pH下降。另外Asp247的侧链在周围空间结构中显得过于拥挤,易与其他侧链产生排斥,由此影响到β-折叠的稳定性,接近亚基结合面的Asp247,可能进一步影响到亚基间相互作用的稳定性,最终导致酶热稳定性的降低。GI酶活和最适pH的改善更利于工业生产。     

葡萄糖异构酶的纯化和拉曼光谱

采用Streptomyces rosechromagenusNo.336细胞丙酮干粉,经抽提、DEAE-纤维素和DEAE-Sephsdex A-50层析,Sephadex G-200凝胶过滤,得到了电泳纯的葡萄糖异构酶,以这种均一态酶测定了其激光拉曼光谱。     

扩展青霉脂肪酶K56R叠加突变对热稳定性的影响

目的:扩展青霉脂肪酶随机突变体ep8是一株热稳定性比野生型有所提高的突变体.获得热稳定性提高的优良菌株.方法:在ep8的基础上利用重叠延伸PCR构建叠加突变重组质粒pPIC3.5K-ep8一K56R,将该质粒电转毕赤酵母(Pichia paaoris)GS115进行异源表达.结果:该叠加突变脂肪酶在毕赤酵母中获得了活性表达.15%SDS-PACE结果分析表明突变脂肪酶PEL-ep8-K56R-GS分子量与野生型PEL-GS一致,约为28kDa.叠加突变脂肪酶在37℃时酶活为852U/mL、野生型为760u/mL、随机突变体为824u/mL,叠加突变体酶活相比野生型提高了21.1%,相比随机突变体提高了3.4%.热稳定性分析数据表明叠加突变脂肪酶Tm值为40.1℃、野生型为38.7℃、随机突变体为39.9℃,Tm值相比野生型提高了1.4℃,相比随机突变体提高了0.2℃.     

碳源和氮源对玫瑰栗色链霉菌No．336产葡萄糖异构酶的影响

玫瑰粟色链霉菌(Streptomyces rosecocastaneus) No. 336变异株对碳源或氮源的利用及其和产葡萄糖异构酶的关系,用半合成培养基进行了摇瓶液体培养试验。测定以15种单精和糖醇、8种寡糖和5种多糖作为碳源,6种含氮化合物作为氮源对菌的生长和产酶的影响。证明N。．336菌株除利用L一阿拉伯糖和D二木糖等五碳糖作为碳源外,也能利用D一葡萄糖等六碳糖作为碳源和能源。糖醇对酶的形成或无明显影响,或有抑制作用。在供试的氮源中,玉米浆和酵母膏对产酶的影响明显优于蛋白胨,该菌几乎不能以无帆氮化合物或乙酸镶作为唯一的氮源。C／N比的试验表明,2：1、1：1或3：1的培养基组成有利于葡萄糖异梅酶的形成,提高氮素含量虽能促进菌的生长,但对产酶不利。以麦麸水解液和玉米浆为主要成分的培养基有利于No.336菌株的生长和产酶,每毫升培养液的酶活力在180单位以上。     

葡萄糖异构酶产生菌筛选培养基和测定方法的比较试验

在本实验室条件下,经试验证明:2%玉米浆,1%玉米粉,0.1%K₂HPO₄,0.1%。MgSO₄.7H₂0是筛选产葡萄糖异构酶(EC 5,3,1.5)放线菌较适宜的培养基。酶反应时使用顾丁烯二酸钠缓冲溶液较好。显色法是测定葡萄糖异构酶比较简便准确的方法。     

GI双突变体GIK253RA198C的构建及其性质分析

以双引物法对葡萄糖异构酶（GI）基因进行定点突变,将突变体基因于大肠杆菌中表达,获得了GI双点突变体GIK253RA198C.研究K253R和A198C双点突变对GI的结构和性质的作用,结果表明GIK253RA198C的热稳定性明显下降,最适反应温度降低5℃.文章从结构和机制上解释了为何同是K253R突变,对SM33 GI和密苏里游动放线菌GI的热稳定性产生不同的影响,认为这是由于Lys253在两种GI结构的位置上存在微小差异,从而使引入的Arg对亚基间的相互作用产生了相反效应所引起.     

树状黄杆菌变株U-616葡萄糖异构酶的研究

以树状黄杆菌（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｒａｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＮＲＲＬ１１０２２为出发菌株,用紫外线对其进行诱变,经筛选得到一株葡萄糖异构酶的高产菌株Ｕ－６１６,其酶活力提高３１％。经保存三年和多次传代复测,其产酶能力保持稳定。其生长和产酶需较高的溶氧水平,最适产酶温度为３０℃,最适产酶ｐＨ为７．０－７．５,铁离子对其生长和产酶无明显的影响。所产葡萄糖异构酶的最适温度为６０－８０℃,最适ｐＨ为７．５－８．５,Ｃｏ２＋和Ｍｇ２＋对酶有激活作用,对金属离子耐受性较强,对Ｃａ２＋不敏感,热稳定性较好。树状黄杆菌变株Ｕ－６１６是一株产胞内葡萄糖异构酶的优良菌株。     

定点突变提高木聚糖酶Umxyn10A的热稳定性

木聚糖酶是微生物半纤维素降解体系中的一种关键酶,被广泛地应用在工业中的多个领域。本研究为了提高木聚糖酶Umxyn10A (ABL73-883.1)的热稳定性,将Umxyn10A与GH 10家族4种耐热木聚糖酶进行多序列同源比对以及三维结构的同源建模分析,选定了Umxyn10A第31位氨基酸位点进行定点突变,将氨基酸Ala (A)突变为Phe (F)。分别将Umxyn10A和Umxyn10AA31F在大肠杆菌中进行重组表达,分析2种重组酶的酶学特性,结果发现,Umxyn10AA31F的最适反应温度为85℃,较野生重组酶提高了5℃;在65℃下的半衰期为105 min,较野生重组酶(15 min)提高了6倍;在70℃下突变重组酶的半衰期为15 min,较野生重组酶(5 min)提高了2倍;与此同时突变重组酶的pH耐受区间较原酶也有一定的增大。结果表明,将第31位氨基酸位点Ala突变为Phe能够显著的提高Umxyn10A的热稳定性。     

植酸酶及其热稳定性研究进展

植酸酶能降解植物性饲料中的植酸盐类,释放出无机磷酸,对于提高饲料中磷的利用率,减轻畜禽高磷排泄物对环境的污染以及促进单胃动物对饲料中矿质营养的吸收利用有重要作用,因此植酸酶的研究有重要的科学和实用价值。获得高活性高热稳定性的植酸酶是近年来植酸酶工业的研究热点和难点,综述了植酸酶及其热稳定性研究的现状和提高植酸酶热稳定性方法的最新进展 。     

Protein Thermostability: Mechanism and Control Through Protein Engineering

Chemical modification and protein engineering especially are now the useful tools for thermo-stabilizing proteins, and also for elucidating the mechanism of protein stability. The information on the mechanism so far accumulated indicate that a single or few amino acid replacement(s) in a protein is/are sufficient to enhance protein thermostability. Salt bridges inside protein molecule or decrease of internal or external hydrophobicity, respectively, may contribute to increased thermostability. However, generalized molecular reasons for protein thermostability and generalized methods for protein stabilization have not yet been proposed. Some of typical examples of the application of protein engineering to stabilize proteins are presented. They are based on information concerning the tertiary structure of the proteins or their related proteins. Even if such structural information is unavailable, one can replace amino acid(s) in a protein by mutagenesis of the gene coding for the protein via the application of chemicals to the gene (or the plasmid harbouring the gene) or organism. A promising strategy involving transfer of the identified gene into a thermophile and subsequent growth at higher temperatures (thermal adaptation) is described.     

Myxococcus sp.V11海藻糖合酶TreS II分子改造 *

来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase, EC 2.4.1.245)TreS II可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力,但TreS II对热敏感,在60℃保温3h,酶活性丧失,限制了其应用范围.目的:拟探索TreS II影响热稳定性的氨基酸残基构成,通过对可能的氨基酸位点进行定点突变,以期获得耐热性的突变子,扩大TreS II应用范围.方法: 通过PCR介导的方法对TreS II可能影响到热稳定性的氨基酸Q3,A283,W374,R449和Y537进行定点突变,以野生型重组酶为对照,比较突变型与野生型的最适反应温度和最适反应pH,通过测定不同温度下保存不同时间后的残留酶活,检测突变子的耐热效果.结果: 研究表明突变子Q3D,A283R,W374D,R449Q和Y537H的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH 和最适反应温度也未发生改变;A283R,Y537H在60℃条件下,3h后活性剩余68%;Q3D,W374D,R449Q在温度60℃时,3h后活性剩余35%.结论: TreS II分子结构中与金属离子结合的几个氨基酸残基的改变对蛋白质分子的耐热性具有显著影响.     

脯氨酸对蛋白质热稳定性的贡献

单一氨基酸的置换可以改变酶的热稳定性。脯氨酸(Pro)残基在蛋白质结构及其热稳定性中具有特殊作用。它十分偏爱β转折或无规卷曲结构,而很少出现在α螺旋和β折叠中。分析认为在改善酶热稳定性的蛋白质工程中,只要主链构象不发生骤变,则可在适当的β转折或无规卷曲中引入Pro,通过其刚性的吡咯烷环,降低蛋白质去折叠时的骨架熵,从而使其周围的构象更合理。这一Pro理论(theprolinetheory)的分子设计新思路将会得到进一步的发展和完善。     

编码序列的（G＋C）%与蛋白质的耐热性相关性分析

运用计算机统计方法,对以木糖异构酶为主的几个蛋白质家族的核酸和氨基酸序列进行分析,发现密码子各位上的（Ｇ＋Ｃ）％与编码序列的（Ｇ＋Ｃ）％成线性正相关,大多数氨基酸的含量与编码序列的（Ｇ＋Ｃ）％也存在相关性,按其相关性,将氨基酸分为正相关,负相关和不相关３类,对木糖异构酶氨基酸序列和酶的耐热性的统计发现,那些在统计学上显著的,可能提高蛋白质耐热性的氨基酸替换,往往伴随关编码序列中ＧＣ含量的上升,这提