一个双价锤头型核酶在体外对两种不同植物病毒RNA的专一切割作用

根据锤头核酶模型,设计合成了一个以黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）外壳蛋白（ＣＰ）亚基因组ＲＮＡ为底物的锤头型核酶（ＲＺＣ）,在证明它能有效切割该底物后,再将这个核酶与一个能专一性切割烟草花叶病毒（ＴＭＶ）移动蛋白（ＭＰ）亚基因组ＲＮＡ的锤头型核酶（ＲＺ１）相互串联构成了一个双价核酶（ＲＺ１Ｃ）,体外结果表明,这个双价核酶能与相应的单价核酶ＲＺ１和ＲＺＣ一样专一而有效地切割ＣＭＶ ＣＰ和ＴＭＶ ＭＰ ＲＮＡ     

双价核酶对烟草花叶病毒的两个靶序列的专一切割作用

报道了两个最简单的多价核酶即双价核酶RZ34和RZl3的构建和体外作用情况。实验结果表明,这两个双价核酶能分别对两个不同的TMV底物或其混合物施行专一切割。双价核酶对单十底物的作用效率与其相应的单价核酶相似。还就双价核酶内的单元核酶的相对位置对其专一性和作用效率的影响进行了探索。     

特异切割12-脂加氧酶mRNA的核酶体外活性及动力学研究

根据锤头状核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割１２－脂加氧酶（１２－ＬＯ）ｍＮＲＡ的核酶基因。以合成的２５个核苷酸长的１２－脂加氧酶ＲＮＡ片段为底物与转录的核酶ＲＮＡ一起保温检测其体 割活性。实验结果表明,在３７℃保温时,核酶在体外对１２－脂加氧酶具有较高的特异切割活性,其Ｋｍ值为１３００ｎｍｏｌ／Ｌ,其ｋｃａｔ值为０．０８３／ｍｉｎ,在５０℃保温时,核酶具有很高的切割     

应用核酶体外切割马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因的研究

针对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因第356～358位点“GUC”．设计、合成了一种“锤头状”核酶。将核酶基因克隆在体外转录载体PSPT19的SP6启动子下游;同时将PLRVCPcDNA亚克隆在体外转录载体pSPT18的SP6启动子下游。利用SP6RNA聚合酶分别体外转录,获得核酶分子和靶RNA序列。在41℃保温进行核酶切割反应,检测到预期大小且被切开的两个RNA短片段。     

核酶的体外合成及其对鸭乙型肝炎病毒S基因体外转录物的定点切割

选择鸭乙型肝炎病毒作为核酶的靶病毒,设计针对病毒前基因组Ｓ基因区第１２８８位和１４６９位“锤头状”核酶序列（ＲＺ１和ＲＺ２）。经体外转录及做核酶切割,ＲＺ１和ＲＺ２均有切割作用,以ＲＺ１作用更强。鉴于核酶在相当于鸭体温（４２℃）有切割作用,因此有可能在鸭体内研究其切割作用。     

特异切割12-脂加氧酶mRNA的核酶体外活性及动力学研究

根据锤头状核酶(Ribozyme)的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割12-脂加氧酶(12-LO)mRNA的核酶基因。以合成的25个核苷酸长的12-脂加氧酶RNA片段为底物与转录的核酶RNA一起保温检测其体外切割活性。实验结果表明,在37℃保温时,核酶在体外对12脂加氧酶具有较高的特异切割活性,其Km值为1300 nmol/L,其kcat值为0.083/min,在50℃保温时,核酶具有很高的切割活性,其kcat值为0.31/min。     

核酶在大肠杆菌内对烟草花叶病毒靶RNA的切割作用

把一段取自TMV RNA的靶cDNA序列连接在一个体内表达转录载体内的报道基因CAT起译密码子ATG的下游组成了读码框不改变的CAT融合基因,通过测定载体在大肠杆菌内表达的CAT活力变化,观察了与CAT同时表达的核酶在体内对靶序列的作用。当专一核酶RZ1、RZ1A或RZ1表达时,CAT的酶活力下降了30%,但非专一核酶RZ3的表达并不改变CAT活力。凝胶电泳和引物延伸结果表明CAT活力的下降是由于这些核酶对融合CAT mRNA在5’靶序列区发生了专一切割从而影响了蛋白的合成所致。     

bcl-2核酶(Ribozyme)促进紫杉醇诱导的细胞凋亡

用核酶技术阻断或降低抗凋亡蛋白 Bcl- 2的表达以促进化疗药物紫杉醇诱导的食管癌细胞凋亡 ,探索克服耐药、提高紫杉醇疗效的新途径 .将特异性切割 Bcl- 2 m RNA的核酶克隆至含MTII启动子并可为 Zn SO4 诱导表达的真核表达载体中 ,通过脂质体转入食管癌鳞状上皮细胞系Eca 1 0 9中 ,经 G41 8筛选得到稳定抗性细胞株 X1 0 9R,挑取单细胞株扩大培养 ,1 40μmol/L Zn SO4诱导 3d,用 Northern- blot、免疫荧光、流式细胞仪鉴定核酶及 Bcl- 2蛋白表达情况 ,用 TUNEL标记及流式细胞术检测凋亡细胞的比例 .bcl- 2核酶在不同单细胞株中有不同程度的表达 ,其中一株X1 0 9R1 4表达最高 .测定其中 Bcl- 2蛋白含量 ,发现 Bcl- 2蛋白表达大为降低 .加入紫杉醇后 ,TUNEL标记及凋亡峰测定结果都表明同一条件下凋亡率升高 .结果提示 ,转入特异性切割 bcl- 2m RNA的核酶可有效地阻断 Bcl- 2蛋白合成 .Bcl- 2蛋白表达降低可明显促进紫杉醇诱导的细胞凋亡 .说明 Bcl- 2蛋白在细胞产生耐药过程中起着重要作用     

特异切割番茄 1-氨基环丙烷羧酸合成酶mRNA的核酶基因序列的合成与克隆

根据番茄1-氨基环丙烷羧酸合成酶(ACC合成酶)基因cDNA序列, 按照锤头状核酶作用模式, 设计合成长度分别为40mer和48mer的一对引物,经体外退火、延伸、连接,插入质粒pGEM-3Zf(+)的KpnI和BamHI位点之间,经菌落原位杂交、双酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳和序列分析证明,人工合成了特异切割ACC合成酶mRNA第667-669位点GUC序列的核酶基因序列。 Abstract:In order to interrupting the ACC synthase activity in tomato,a hammerhead ribozyme targeting to cleave GUC triplet at the position 667~699 of ACC synthase mRNA was established and integrated into KpnI and BanHI site of vector pGEM-3Zf(+).Four positive clones were gotten by in situ hybridization.The recombinatant plasmids were digested with restriction endonuclease KpnI and BanHI.By polyacrylamide gels electrophoresis and sequence analysis,the size and the sequence of one of the digested product was the same as those of what we expected.These results showed that the ribozyme gene sequence has been obtained.     

Monitoring Retroviral RNA Dimerization In Vivo via Hammerhead Ribozyme Cleavage

We have used a strategy for colocalization of Psi (Ψ)-tethered ribozymes and targets to demonstrate that Ψ sequences are capable of specific interaction in the cytoplasm of both packaging and nonpackaging cells. These results indicate that current in vitro dimerization models may have in vivo counterparts. The methodology used may be applied to further genetic analyses on Ψ domain interactions in vivo.     

抗HPV11／E2基因Ribozyme对靶RNA的体外剪切研究

为了寻找HPV11型引起的生死系统感染的治疗途径和探讨HPV的致病机理,本实验以HPV11病毒质粒为模板,扩增出HPV11型E2区644bp片段,采用pEGM-T-Easy Vector为载体,构建pTV-644克隆载体,经筛选得到克隆株,取质粒测序鉴定,采用上海生化所陈农安教授编制的锤头状Ribozyme设计软件进行计算机分析,选择Ribozyme对靶基因的最佳剪切位点,及进行基因同源性分析和生物学功能分析,选择出针对HPV11 E2靶基因的RZ2777,在最适条件下进行体外剪切反应,发现人工合成和体外转录得到的Ribozyme分子均能在相应位点准确切割靶RNA分子,选择合适的反应条件切割效率达60％以上,Km和Kcat值分别为0.63μmol／L、0.12μmol／L、RibozymeL两端的5′c－is－ribozyme和3′－cis－ribozyme自我剪切释放并未影响切割活性,但靶RNA侧翼序列影响了Ribozyme的剪切活性。实验研究表明,Ribozyme可能成为治疗HPV11型引起的尖锐湿疣的有效手段,并有望在分子水平上开辟出基因治疗HPV11病毒感染的另一新天地。     

固定化锤头状ribozyme的初步研究

用共价连接方式将专一切割苜蓿夜蛾核多角体病毒多角体蛋白ｍＲＮＡ片段的锤头状ｒｉｂｏｚｙｍｅ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄｒｉｂｏｚｙｍｅ）固定在ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ上,ｒｉｂｏｚｙｍｅ与载体之间有１９个原子的距离,研究并比较了该固定化ｒｉｂｏｚｙｍｅ与游离（非固定化）ｒｉｂｏｚｙｍｅ的底物专一性、催化活性、最适反应温度以及热和保存稳定性。讨论了固定化ｒｉｂｏｚｙｍｅ与固定化酶在性质上的相似性以及固定化ｒｉｂｏｚｙｍｅ研究在理论和应用上的可能意义。     

锤头型核酶作用机理的研究进展

概述了锤头型核酶的二级结构特征,动力学反应的特点以及核酶切割反应的催化机制,提出了锤头型核酶作用机理有待于深入研究的问题.     

Ribozyme和DNAzyme的基因治疗实验应用进展

Ribozyme和DNAzyme具有水解mRNA分子的功能,是阻断基因表达和抗病毒的重要工具。近年来,Ribozyme和DNAzyme在临床治疗研究中已经获得了长足进展,有许多成功的实例。比较了Ribozyme和DNAzyme的差异和特点,总结了它们在抗病毒、抗肿瘤、治疗遗传病、治疗神经系统疾病等方面的临床前研究、应用及进展。