大肠杆菌His_6融合表达载体及其表达产物的一步纯化

构建了Ｔ７启动子控制下的融合表达载体,使外源蛋白以Ｎ端与６个连续的组氨酸残基（Ｈｉｓ６）融合的形式表达。这些载体含有强Ｔ７启动子、终止子、翻译起始区、多克隆位点以及噬菌体ｆ１复制起始区,使外源基因不仅可以得到高效表达而且可以利用ｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ包装单链ＤＮＡ,从而不需亚克隆就可以直接进行测序及点突变。在多数情况下,表达产物均得到可溶性表达。Ｈｉｓ,融合表达产物可经金属离子（Ｎｉ２＋）配体亲和层析一步纯化,纯化既可在天然状态下进行,也可以在变性状态下进行。利用上述融合表达载体高效活性表达了Ｈｉｓ,融合的小鼠ｃＡＭＰ依赖的蛋白激酶催化亚基,并经金属离子（Ｎｉ２＋）配体亲和层析一步分离纯化得到均一蛋白。     

T7启动子控制下的多功能大肠杆菌表达系统

构建了Ｔ７启动子控制下的多功能大肠杆菌表达载体系统,这些表达载含有强的Ｔ７启动子,翻译起始及终止元件,多克隆位点,线状噬菌体复制起始区等元件,使得该载体就仅可以有效地表达外源基因、还可能利用ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ诱导包装单链噬菌体,从而不需亚克隆就可以进行突变及ＤＮＡ序列测定。     

含P_RP_L启动子的原核高效表达载体的组建及其应用

我们组建了一个含P_RP_L自动子的原核高效表达载体,它同时含有cI调控基因、多酶切点和两个强的转录终止序列。带起始密码子ATG的外源基因可以插入启动子下游的多酶切点,表达非融合蛋白,产品可供临床使用。我们实验室已用它成功地表达了人γ干扰素、人白细胞介素-2和人肿瘤坏死因子等,表达量均占菌体总蛋白的20％以上。     

cIts857基因的克隆、修饰及温敏诱导表达载体

从噬菌体λＤＮＡ（ｃＩｉｎｄｌｔｓ８５７Ｓａｍ７）克隆出９９０ｂＰ的ｃＩｔｓ８５７基因,经缺失,点突变等修饰改造和ＤＮＡ序列测定,获得了带有自身启动子区的修饰型ｃＩｔｓ８５７基因（７７０ｂｐ）。进而利用它构建大肠杆菌表达载体ｐＢＬＭＶＬ２和一套含３种不同阅读框架ｌｉｎｋｅｒ区的表达载体ｐＢＬＭＦＶ４、５Ｂ、６。上述表达载体;用于表达人工合成的牛生长激素（ｂＧＨ）、人干扰素－γΔＣ－１３和酵母ｐｈｏ８５等外源基因,都观察到这些基因产物的温敏表达。这些表明,克隆、修饰并组建到表达载体中的λ噬菌体ｃＩｔｓ８５７基因表达出具有功能作用的转录阻遏蛋白,使上述ＰＬ启动子控制下的大肠杆菌表达载体可经温敏诱导而高效表达外源基因产物．     

酪氨酸激酶EphB2受体N端球状结构域的表达及纯化

根据酪氨酸激酶ＥｐｈＢ２受体的碱基序列,用ＰＣＲ方法扩增其结合配体的关键结构域Ｎ端球状区,定向克隆到融合表达质粒载体ｒＲＳＥＴ Ａ中,转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）。阳性克隆经ＩＰＴＧ诱导,由Ｔ７启动子调控表达了氨基端带６个连续组氨酸残基的融合蛋白。电泳分析表明,表达的融合蛋白主要以包含体的形式存在,约占细菌总蛋白的１４％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹确证,利用Ｎｉ－ＮＴＡ金属螯合亲和色谱法在变性条件下对     

外源基因的靶向细胞表达

使外源基因在特定组织细胞中进行表达主要采用两方：一是使用靶向基因载体，这种载体可识别特定组织细胞膜上的一些分子，并与之结合，然后再将外源基因带入细胞中表达；另一种方式是使用组织细胞专一的启动子，来驱动外源基因在该细胞中的特异性表达。     

利用Tol2转座子构建斑马鱼心脏组织特异表达转基因载体及其表达分析

为了制备用于在斑马鱼心脏中特异表达目的基因的转基因载体,通过分子克隆的方法对能够在斑马鱼心脏中特异表达EGFP报告基因的Tol2载体进行了改造,在原有的CMLC2启动子与EGFP编码区之间插入带有多克隆位点的IRES序列,获得pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体,该载体可以实现在同一个启动子CMLC2的驱动下分别同时表达目的基因和EGFP;为了验证该表达载体的有效性,进一步在CMLC2启动子与IRES序列之间插入DsRed-Monome编码区,利用得到的pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP转基因载体显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎中进行表达分析,结果表明外源目的基因DsRed-Monome和报告基因EGFP均能以相同的表达模式在斑马鱼心脏组织中特异表达。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体的成功构建对于建立心脏发育候选基因的斑马鱼转基因实验模型具有重要意义。     

β乳球蛋白基因（βlg）的表达调控及其应用

β乳球蛋白（BLG）是反刍动物乳汁中的主要乳清蛋白,BLG表达受到βlg核心启动子,LCR,MAR等顺式作用元件和激素,转录因子等反式作用因子的调控,利用βlg启动子已在乳腺成功表达外源基因,但乳腺组织特异性表达外源基因时尚存在异位表达,差异表达,表达水平低和表达受位置效应影响等问题,构建表达载体时充分考虑βlg启动子和远端调控元件,有可能使上源基因获得,高效,特异的表达。     

具有重要应用价值的真核表达系统

基于Ｔ７ＲＮＡ聚合酶与Ｔ７强启动子（１０）间的特异识别而建立起来的偶联表达系统在大肠杆菌中已取得了令人满意的结果。最近,该系统在酵母、昆虫、哺乳动物细胞和植物细胞中陆续实现了高效表达。Ｔ７ＲＮＡ聚合酶－１０启动子偶联表达系统的相对独立性和高效性,不仅预示着该系统可以在真核基因工程中发挥重要作用,而且其独特的作用机制为人们探索新的特异高效真核表达系统提供了一个可供借鉴的模式 。     

噬菌体T7溶菌酶及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

以噬菌体Ｔ７ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ扩增Ｔ７溶菌酶基因,插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ载体中,ＤＮＡ序列分析表明,克隆的Ｔ７溶菌酶基因和已报道的序列无氨基酸水平上的差异。将Ｔ７溶菌酶基因分别拼接在烟草病原相关蛋白（ＰＲ１ｂ）信号肽编码序列的３’末端和马铃薯卷叶病毒外壳蛋白（ＰＬＲＶＣＰ）基因靠近３’末端处,构建成两个融合蛋白基因。将Ｔ７溶菌酶及其融合蛋白基因插入大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２１,蛋白电泳及溶菌实验表明,Ｔ７溶菌酶基因在大肠杆菌中高效表达,其产物的表达量占菌体可溶性蛋白的２０％以上,ＰＬＲＶＣＰ的表达量并没有因Ｃ端融合Ｔ７溶菌酶而提高,高等植物的信号肽在大肠杆菌中也能起分泌信号作用。     

T7启动子在哺乳类动物细胞中启劝外源基因表达的研究

人低密度脂蛋白（ＬＤＬ）受体基因ｃＤＮＡ和氯霉素乙酰转移酶基因（ＣＡＴ）及ｐｏｌｙＡ信号序列被克隆进行ＰＧＥＭ４载体的Ｔ７噬菌避动子下游,构建成质粒ＰＴ７ＬＤＬＲ和ＰＴ７ＣＡＴ,两个重组质粒转化ＣＨＯ细胞,ＰＣＲ和ＣＡＴ酶实验显示：两个基因被Ｔ７噬菌体启动子所启动,结果证实真核生物ＲＮＡ聚合酶能够识别Ｔ７启动子,转录外源基因,常用的含有Ｔ７启动子的质粒可同时的核生物和真核生物的表达载体。     

具有重要应用价值的真核表达系统

基于Ｔ７ＲＮＡ聚合酶与Ｔ７强启动子（Φ１０）间的特异认识而建立起来的偶联表达系统在大肠杆菌中已取得了令人满意的结果。最后，该系统在酵母、昆虫、浦乳动物细胞和植物细胞中陆续实现了高效表达。Ｔ７ＮＲＡ聚合酶－Φ１０启动子偶联表达系统的相对独立性和高效性，不仅预示着该系统可以在真核基因工程中发挥重要作用，而且其独特的作用机制为人们探索新的特异高效真核表达系统提供了一个可供借鉴的模式。     

非常规酵母基因工程表达系统

非常规酵母系指除了酿酒酵母与粟裂殖酵母之外的酵母曹。非常规酵母可利用其自主复制序列构建载体,但整合载体是进行外源基因导入的主要方式。非常规酵母的转化有一定的宿主范围,可采用与酿酒酵母相同的方法,最常用的仍为化学法。高效表达元件可利用酿酒酵母的强启动子,也可以根据非常规酵母菌的代谢特点寻找强启动子．本文综述了近年来应用非常规酵母基因表达系统表达外源基因的一些实例。     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β─半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的、有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

在哺乳类动物细胞中呈现不同表达水平的T7启动子表达系统构建

将携带有Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶基因的质粒和ｎｅｏ抗性基因质粒共转化ＣＨＯ细胞,经狭缝ＲＮＡ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交实验证实获得表达Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶基因的细胞株。ｐＴ７ＣＡＴ质粒转染未表达和表达的细胞株,实验显示两者都能表达报道基因,但效率不同。实验构建了不同表达水平的Ｔ７启动子表达系统。     

Mn-SOD与抗癌胚抗原单链抗体基因的融合及高效表达

将Ｍｎ－ＳＯＤ与抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因（Ｓｃ－Ｆｖ ｇｅｎｅ）融合,重组到含Ｔ７启动子的表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中,构建表达质粒ｐＥＴＭｎ－ＳＯＤ－ＳｃＦｖ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行高效表达,表达物占菌体可溶性总蛋白的２４％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质和迹图谱显示表达物分子量为４５ｋＤ与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在大肠杆菌中为泌型表达有利于纯化。ＲＩＡ测定表     

甘露碱合成酶基因启动子调控的萤光素酶基因在转化烟草中的表达

利用我们自己分离的甘露碱含成酶基因启动子与萤光素酶结构基因、胭脂碱合成酶基因’3末端结构相拼构成一融合基因,并在带有此融合基因的中间载体PBZ7610插入Ti质粒T区的tmr基因,构成中间载体pBZ7621。利用改建的Ti质粒载体PGV3850,将萤光素酶融合基因引入了烟草植株,结果表明,萤光素酶融合基因在转化烟草中能表达。中间载体pBZ7610还带有PstⅠ,HindⅢ,XbaⅠ等多个单一的酶切位点,外源基因极易插入。利用中间载体pBZ7621,还可研究启动子在高等植物不同发育阶段中的功能特征。     

不同启动子驱动下转基因盐藻外源基因的稳定表达

摘要：为了探讨外源性与内源性启动子对转基因盐藻外源基因表达的影响,将含外源性启动子CMV35S的表达载体CMV35S-bar（G12）和含内源双拷贝碳酸酐酶启动子DCA1的表达载体DCA1-bar（D-B）分别转化盐藻,筛选稳定转化株后,观察在不同启动子驱动下外源基因的表达情况及对转基因盐藻生长的影响。 通过电击法分别将表达载体G12 和D-B转化盐藻,经PPT筛选后,各得到了3株PPT抗性藻株,经PCR及测序分析证实外源基因bar已经整合到盐藻的基因组中,半定量RT-PCR结果显示,在内源性启动子DCA1驱动下,bar基因的表达强度明显高于在外源性启动子驱动下bar的表达,并且D-B转化株的bar基因表达在盐诱导下其表达明显提高,而G12转化株中bar基因的表达对盐诱导无反应。Southern blot 分析显示,外源基因的拷贝数与不同启动子间无相关性。转化株的生长特性分析显示,D-B转化株的生长速度明显高于G12转化株。本研究的结果指出,内源诱导型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效稳定表达中比外源组成型启动子更具有优势。     

一种新型巴斯德毕赤酵母表达载体的构建及甘露聚糖酶的表达

目的:构建以带自身启动子的蔗糖转化酶基因(suc2)为选择标记的载体,用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法:根据已发表的蔗糖转化酶基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以啤酒酵母INVSC1总DNA为模板,扩增出包含自身启动子和终止区序列的suc2基因。将该基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了以suc2为选择标记的表达载体pPIC12K。将甘露聚糖酶基因man克隆入载体pPIC12K,用PEG/LiCl法转化毕赤酵母GS115菌株。以蔗糖为惟一碳源筛选转化子,利用底物平板检测筛选到的转化子中man基因的表达,并对重组表达菌株进行连续传代实验。结果:部分转化子周围产生明显的水解圈,证明甘露聚糖酶已经得到分泌表达;对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的遗传稳定性。结论:以带自身启动子的suc2基因为选择标记的表达载体构建成功,并且这个新型表达载体能够对外源基因进行稳定有效的分泌表达。     

金属硫蛋白突变体的植物高效表达载体的构建及其在烟草中的表达

金属硫蛋白有α、β两个结构域（ｄｏｍ ａｉｎ）,其中α结构域优先结合Ｃｄ２＋ 和Ｈｇ２＋ ．小鼠αα突变体在大肠杆菌中已经构建并得到表达,其转基因植株已得到,可在Ｃｄ３００（３００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．为了进一步提高外源基因在烟草中的表达量,首先用ＰＣＲ 的方法设计引物,在基因翻译起始密码子ＡＴＧ 附近加入植物偏爱的碱基组合ＡＡＣＡＡＴＧ．另外,将该突变体基因插入具有双３５ Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）强启动子的植物双元表达载体ｐＧＰＴＶｄ３５Ｓ－ＢＡＲ中,获得了带有αα突变体的植物双元表达载体．通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草ＮＣ８９,获得了抗除草剂的转基因植株．经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 和蛋白Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测,证明了αα突变体在烟草中的嵌合与表达．抗重金属实验证明转基因烟草可以在Ｃｄ４００（４００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．