酵母PHO2与PHO4蛋白的激活活性的分析及两者的相互作用

ＰＨＯ２与ＰＨＯ４是酵母ＰＨＯ５基因的两个正调控因子,本文发现,ＰＨＯ２与酵母转录因子ＧＡＬ４的ＤＮＡ结合功能域融合后就能激活报道基因ｌａｃＺ的表达,其激活力受高低磷影响,表明ＰＨＯ２蛋白上存在酸性转录激活区。ＰＨＯ２蛋白上酸性氨基酸丰富的２８７－３２６肽段并非ＰＨＯ２的激活区。在ＰＨＯ２蛋白上２３０位Ｓｅｒ处于磷酸化状态２ＰＨＯ２才有激活作用,表明了这一磷酸化位点可能与ＰＨＯ２的转录激活能力有关     

应用实时BIA研究酵母PHO4和PHO2的相互作用

应用实时生物分子相互作用分析技术（ＢＩＡ）分析了酵母ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白的相互作用。将ＰＨＯ４蛋白通过氨基耦联在感应片上。进样５μｍｏｌ／Ｌ重组的谷胱甘肽转移酶融合的ＰＨＯ２蛋白（ＧＳＴ－ＰＨＯ２）及其两种突变体融合蛋白。结果表明ＰＨＯ２的２３０位丝氨酸变为天冬氨酸的突变体（ＧＳＴ－２ＳＤ）与ＰＨＯ４有强的表面等离子体激元共振信号,而生型ＰＨＯ２和２３０位丝氨酸变为丙氨酸的突变体（ＧＳＴ－２ＳＡ     

PHO4和PHO2蛋白与PHO81基因调控序列的相互作用

高效表达产纯化了ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白,凝胶阻抑电泳分析证明了ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白与ＰＨＯ８１上游－４０１－２８９ｂｐ片段的结合,定点突变ＰＨＯ２的２３０位丝氨酸为天冬氨呈丙氨酸,不影响ＰＨＯ２蛋白与此片段的结合。足迹法分析证明了ＰＨＯ４结合在ＰＨＯ８１基因上游的３５４－３３３ｂｐ,ＰＨＯ２结合在３４１－３３４ｂｐ。因此,这些结果表明－４０１－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,     

醇母PHO81基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游序列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得到完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ８１基因的表达水平,研究了它的表达作用。ＰＨＯ８１基因为阻遏型表达,受无机磷浓度的控制,高磷使基因表达阻遏,低磷去阻遏。ＰＨＯ８１对其自身的表达有正调控作用,它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１基因的调控模式相似,但ＰＨＯ８１上游调控序列和ＰＨＯ５及ＰＨＯ１１的同源性很低。     

酵母PHO4基因的克隆与表达

用原位杂交方法从酵母菌染色体ＤＮＡ中分段克隆,拼接,获得完整的ＰＨＯ４基因,全长约３．４ｋｂ,利用体内同源重组的方法,构建了ＰＨＯ４基因缺失突变株。ＰＨＯ４基因的缺失导致酸性磷酸酯酶活性明显下降,将完整的ＰＨＯ４基因转入这种缺陷细胞,能使酶活性回复到野生型水平,ＰＨＯ４起正调控作用,构建ＰＨＯ４－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ４的表达水平。融合基因不同名的表达表明,ＰＨＯ４基因     

酵母PHO80基因的克隆,表达及功能分析

利用原位杂交方法从野生型酵母菌染色体ＤＮＡ中克隆了ＰＨＯ８０基因,全长约４．２ｋｂ,包括１．１ｋｂ的上游序列和８７９ｂｐ的编码序列。以ＵＲＡ３基因为筛选标记,通过体内同源重组和营养互补筛选获得了ＰＨＯ８０基因缺失突变株。进一步研究了ＰＨＯ８０在细胞内的功能,它是酵母阻遏型酸性磷酸酯酶结构基因以及调控基因ＰＨＯ８１表达的负调控因子,但不影响ＰＨＯ４和ＰＨＯ８５的表达。还构建了ＰＨＯ８０－ＬａｃＺ融合基因,探索它在细胞内的表达规律。β－半乳糖苷酶活力测定结果表明,ＰＨＯ８０基因在细胞内呈低水平表达,并受自身产物和ＰＨＯ８５的抑制,推测它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ８１基因的调控模式可能相似。     

酵母PHO2蛋白的磷酸化研究

本文报道了ＰＨＯ２蛋白能被一种未知的蛋白激酶磷酸化。ＰＨＯ２蛋白的第２３０－２３３位氨基酸残基因组成一个可能ｐ３４＾ｃｄｃ３／ＣＤＣ２８相关的蛋白激酶识别的一致序列,用点突变的方法将Ｓｅｒ－２３０变成Ａｌａ可导致ＰＨＯ２蛋白激活ＰＨＯ５表达能力的完全丧失。     

酵母PAP1与PHO85激酶复合物对PHO4的磷酸化

酵母ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＡＰ１与其它的ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＨＯ８０、ＰＣＬ１及ＰＣＬ２有较高的同源性。我们上ＰＡＰ１与ＨＡ抗原的融合基因,利用抗－ＨＡ抗体进行免疫沉淀。体外翻译的融合ＨＡ标记肽的ＰＡＰ１与体外翻译的ＰＨＯ８５的免疫共沉淀证明了ＰＡＰ１与ＰＨＯ８５的结合。同时纯化了大肠杆菌表达的ＰＨＯ４蛋白,并构建了Ｐ９ＨＯ８５：：ＰＲＰ１缺失株。ＰＡＰ１与ＨＡ的融合基因被置于酵母ＡＤＨ１启动子的控     

酵母转录因子PHO81基因的上游序列功能分析

利用ＰＨＯ８１ｌａｃＺ融合基因,对它的上游进行缺失分析,发现有两个区域对ＰＨＯ８１基因的表达是必需的：－４０１～－２８９ｂｐ和－１０１２～－８０１ｂｐ。比较ＰＨＯ８１和ＰＨＯ５,ＰＨＯ８４基因上游,未发现有较高同源性的序列存在,但在－４０１～－２８９ｂｐ区域有ＰＨＯ４蛋白结合位点的核心序列５′ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ３′,以及ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ两侧富含Ａ／Ｔ的序列（可能是ＰＨＯ２结合位点）。推测－４０１～－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,－１０１２～－８０１ｂｐ可能起增强的作用。用酵母总蛋白质对－１０１２～－８０１ｂｐ进行凝胶阻抑电泳分析,证明有未知的蛋白因子结合在这个区域。     

酵母PHO81在酸性磷酸酯酶基因表达调控中的作用

利用酵母ＰＨＯ８１与大肠杆菌β－半乳糖苷酶的融合基因,系统地研究了ＰＨＯ８１基因在酵母酸性磷酸酯酶的不同调控因子的单缺失株和双缺失株中的表达规律,它与酸性磷酸酯酶基因ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１的控制机制相似。构建 了ＡＤＨ１启动子控制下ＰＨＯ８１表达质粒。在ＰＨＯ８１在细胞内组成型表达时,酸性磷酸酯酶基因的表达仍受无机磷的控制,提示ＰＨＯ８１蛋白可能在不同浓度无机磷条件发生变构。ＰＨＯ８１的酸性磷酸酯酶     

酵母PHO2蛋白及其变异体与PHO5USA体外的相互作用

酵母ＰＨＯ２蛋白及其变异体与ＰＨＯ５ＵＳＡ体外的相互作用杨军,敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,２０００３１）关键词酵母;ＰＨＯ２;突变;ＤＮＡ结合ＰＨＯ２是酵母阻遏型酸性磷酸酯酶基因转录的正调控因子［１］,由５５９个氨基...     

酵母酸性磷酸酯酶转录调控因子PHO2的功能域分析

利用定点诱变,氨基酸插入或缺失的方法对ＰＨＯ２进行结构改造,观察对其功能的影响。ＰＨＯ２蛋白的同源域中有α－螺旋２－β－转我－α螺旋３的结构,是转录因子结构ＤＮＡ的功能域。定点诱变α－螺旋３上的Ｉｌｅ１２３为Ｐｒｏ１２３或者在α－螺旋２中插入ＰＤＰＤ４个氨基酸,破坏α－螺旋的结构,可导致ＰＨＯ２功能的丧失。氨基酸片段的缺失分析表明,Ｎ端Ｇｉｎ丰富区大部缺失,对ＰＨＯ２功能没有影响;而包含酸性氨基酸     

酵母PHO85基因的定点诱变和功能分析

克隆酵母ＰＨＯ８５基因，用ＵＲＡ３基因取代其部分编码序列，通过染色体同源重组的途径，构建ＰＨＯ８５缺失突变株。以细胞内酸性磷酸酯酶的活力水平显示ＰＨＯ８５的功能作用。完整ＰＨＯ８５基因转入缺陷型酵母菌，能使表达回复，位点专一诱变的ＰＨＯ８５基因（Ｇｌｙ１３→ＡＳＰ或ＬＹＳ３３→Ｇｌｕ）丧失此种功能。ＰＨＯ８５与ＣＤＣ２８编码的蛋白激酶有较高的同源性。ＰＨＯ８５的Ｇｌｙ１３和Ｌｙｓ３３相当于蛋白激酶     

酵母PH081基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷敏的     

酵母PH081在酸性磷酸酯酶基因表达调控中的作用

利用酵母ＰＨＯ８１与大肠杆菌产β－半乳糖苷酶的融合基因,系统地研究了ＰＨＯ８１基因在酵母酸性磷酸醋酶的不同调控因子的单缺失株和双缺失株中的表达规律,它与酸性磷酸酯酶基因ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１的控制机制相似。构建了ＡＤＨ１启动子控制下ＰＨＯ８１表达质粒。在ＰＨＯ８１在细胞内组成型表达时,酸性磷酸酯酶基因的表达仍受无机磷的控制,揭示ＰＨＯ８１蛋白可能在不同浓度无机磷条件发生变构。ＰＨＯ８１在酸性磷酸酯酶基因表达系统中是一个中介因子。在此基础提出了一个酸性磷酸酯酶基因调控的分子模型。     

酵母转录因子PHO81锚蛋白重复序列表达和功能分析

酵母转录因子ＰＨＯ８１蛋白含有６个锚蛋白重复序列。将ＰＨＯ８１锚蛋白重复序列与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合表达（ＧＳＴ－ＡＮＫ）,表达产物以包含体形式存在。利用氧化型和还原型谷城肽系统对包含体进行复性,得到了可溶性蛋白,亲和纯化后,进行了活性分析。通过免疫共沉淀、分别制备了ＰＨＯ８５－ＰＨＯ８０和ＰＨＯ８５－ＰＡＰ１激酶复合物,用重组的ＰＨＯ４蛋白作底物,在激酶反应体系中加入ＧＳＴ－ＡＮＫ,发现它     

多孔菌液体发酵的研究

多孔菌Ｐｏｌｙｐｒｏｕｓｅｌｅｇａｎｓ（Ｂｕｌｌ）Ｆｒ。是一种新开发的真菌类中药材资源,经对其几个主要液体发酵培养条件的筛选研究,初步得出多孔菌深层发酵的基础参数：ＰＨ５．６～０．１;温度２４～２８℃;培养基为麦麸２．５％,蔗糖４％,ＮＨ４ＮＯ３０．０５％,ＫＨ：ＰＯ４０．０５％,ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０２５％。另外,摇瓶种子培养条件是：ＰＨ５．６～６．１;温度２８℃;培养基为ＰＤＡ＋ＶＢ１,添加３‰琼脂,时间为９６ｈｒ。     

高产稳产聚羟基烷酸的重组大肠杆菌的构建

重组大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ） 含有携带聚羟基烷酸（ＰＨＡ） 合成基因（ ｐｈａＣＡＢ）＊＊ 的质粒ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ,是很有潜力的ＰＨＡ 生产菌,但存在着质粒不稳定和不能合成３羟基丁酸（３ＨＢ） 与３羟基戊酸（３ＨＶ） 共聚物［Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ）］ 的缺陷。将ＲＫ２ 质粒上的ｐａｒ ＤＥ 基因引入ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ 构成质粒ｐＪＭＣ２ ,该质粒可以在宿主Ｅ．ＣｏｌｉＨＭＳ１７４ 中稳定遗传。将培养基中的磷酸盐浓度降至１８ ｍ ｍｏｌ／Ｌ,发现Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ｐＪＭＣ２） 能够以丙酸为前体合成Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ） ,其中３ＨＶ 在共聚物中的含量为５ ％ ～８ ％ 。在５Ｌ自动发酵罐中分批补料培养Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ｐＪＭＣ２） ,培养基初始磷酸盐浓度为１５ ｍ ｍｏｌ／Ｌ,３０ ｈ 后每升培养液中干菌体可达４２－５ ｇ,Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ） 占干重的７０ ％ ,其中３ＨＶ 在共聚物中的含量为４－９ ％ 。     

酵母PHO85结合蛋白PAP1基因的克隆和表达

酵母调探因了ＰＨＯ８５是一个依赖于细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）的蛋白酶（ＣＤＫ）,参与对细胞周期和酸性磷酸酯酶基因表达的调控。冯ＰＨＯ８５为靶分子,利用酵母的染色体基因文库中克隆到了一个新的与ＰＨＯ８５相结合的蛋白因子的基因,利用酵母双杂交（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ）系统从酵母的染色体基因文加中克隆到了一个新的与ＰＨＯ８５相结合的蛋白因子的基因,将此蛋白质命名为ＰＡＰ１（ＰＨＯ８５ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ     

斯达油脂酵母U9018产胞外多糖的适宜条件

研究了斯达油脂酵母Ｕ９０１８产胞外多糖的适宜条件：培养基组成（ｇ／Ｌ）：蔗糖１００,蛋白胨７,ＫＨ_２ＰＯ４３５,Ｋ_２ＨＰＯ_４·３Ｈ_２Ｏ_３．５,ＭｇＳＯ_４·７Ｈ_２Ｏ０．２,ＭｎＳＯ_４·Ｈ_２Ｏ０．０１,ＦｅＳＯ_４·７Ｈ_２Ｏ０．０１,ＮａＣｌ０．０１,初始ＰＨ６．５。装液量