慈菇匍匐茎中分泌道的初步研究

慈茹匍蔔茎的分泌道是裂生的胞间道,分布于匍匐茎的基本组织中。单个分泌道原始细胞起始于离茎端约1毫米处的基本分生组织中,原始细胞经分裂形成5—7个上皮细胞包围着中央的裂生腔隙,成为管道系统。上皮细胞无鞘细胞包围。上皮细胞中高尔基体和内质网发达,并溢出小囊泡向着分泌道腔隙面壁的质膜附近迁移,乳汁中亦存在大量完整的小囊泡。上皮细胞和外围薄壁细胞之间的壁层具有大量胞间连丝,小囊泡和内质网的膜结构与胞间连丝末端相接,同时可见上皮细胞的质膜在数处反折内陷,形成袋状结构,在与上皮细胞相对的薄壁细胞内也有同样现象出现,袋状结构内含小形颗粒或囊泡,并在结构上显示出上皮细胞与相邻薄壁细胞间存在着活跃的物质交流。由此认为。代谢物质以整体小囊泡的形式经胞间连丝或内陷的质膜向分泌道迁移是物质运输和分泌的可能方式之一。在电镜下观察,液泡中的积聚物与乳汁十分相似,液泡可能是乳汁的贮存场所之一。     

矮慈菇居群的数量分类研究

本文运用聚类分析和主成分分析基础上构造最小生成树的方法,对采自中国南方的7个矮慈菇居群用28个形态学性状进行了数量分类研究。结果划分出3个类群,综合反映了各居群间的亲缘关系。本文还简要讨论了数量分类学方法在居群生物学中的应用问题。     

慈菇蛋白酶抑制剂A和B的活性中心探讨

慈菇蛋白酶抑制A和B（APIA和APIB）是一种双头多功能抑制剂。它们的一级结构和cDNA序列已经被阐明。为了找到它们的活性中心,利用定点诱变的方法将APIB中根据与其他抑制剂家族的序列比较所推断的可能的活性中心残基;Lys^44,Arg^76和Arg87分别用Pro替代,所得到的突变基因分别在酵母分泌体系中得到了表达,与天然的APIB相比,K^44P-APIB对脂蛋白酶的抑制活力没有改变;而R^76P-APIB和R^87P-APIB对胰蛋白酶的抑制活力都分别下降了一半,由原料的抑制两分子变成了一分子,表明Arg^76和Arg^87分别是APIB的两个活性中心残基,而Lys^44则不是,为了证实以上结论,进一步制备了另外3种突变体（K^44P-R^76P-APIB,K^44P-R^87P-APIB,R^76P-R^87P-APIB)。在每个突变体中,3个可能的活性位点中只保留1个,有关的抑制活力测定表明,K^44P-R^76P-APIB(只保留Arg^87)和K^44P-R^87P-APIB(只保留Arg^76)分别只抑制一分子胰蛋白酶,而R^76P-R^87P-APIB(只保留Lys^44)对胰蛋白酶基本不抑制,从而肯定了以上结论,经过测定,两个突变体K^44P-R^87P-APIB对胰蛋白酶的抑制常数Ki分别是0.39nmol/L和0.47nmol/L。突变体R^87L-APIB(APIA中87位是Leu)丧失了接近一半的胰蛋白酶抑制活力,但同时对胰凝乳蛋白酶的抑制活性由原来的基本不抑制变成和APIA相同的可以抑制一分子,证明了Leu^87是APIA的抑制胰凝乳蛋白酶的活性中心位点。     

慈菇蛋白酶抑制剂通过花粉管途径对小麦的导入及转基因植株分析

慈菇蛋白酶制剂（ＡｒｒｏｗｈｅａｄＰｒｏｔｅｉｎａｓＩｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＡＰＩ）是来源于慈菇（Ｓａｇｉｔｔａｒｉａｔｒｉｆｏｌｉａ）储藏器官的一种天抗虫物质,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂类,能抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和激肽释放酶,对某些鳞翅目,双翅目以及鞘翅目等昆虫有毒杀作用。     

慈菇蛋白酶抑制剂研究进展

蛋白酶抑制剂是一类能够抑制蛋白水解酶活性的物质。根据它们抑制的蛋白酶类型可分为丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、和金属蛋白酶抑制剂[1] 。由于它们能抑制昆虫肠道内以及一些病原微生物体内的蛋白酶[2～ 6 ] ,因此蛋白酶抑制剂在植物对昆虫和病原体的侵染防御系统中具有重要的作用。慈菇蛋白酶抑制剂Ａ、Ｂ是从慈菇球茎中分离纯化的双头多功能蛋白酶抑制剂 ,除了具备其他蛋白酶抑制剂在抗虫抗病方面的特点外 ,还有很多独特的优点。如 ,含量丰富、比活力高而且稳定 ;广谱性强 ;对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶等多种蛋白酶有较强的抑…     

慈菇（Sagittaria safittifolia）α—半乳糖苷酶的纯化与性质

以对硝基苯糖苷基为底物,测定了慈菇的１２种糖苷酶,其中α－甘露糖苷酶,α－和β－半乳糖苷酶活力较高,经硫酸铵分级沉淀,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０分子筛层析,ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ离子交换层析,从慈菇抽提液纯化了α－半乳糖苷酶,纯化酶的比活提高１０７２倍,活力回收１５．６％,在圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上均显示了１条蛋白质带,在     

人双专一性磷酸酶活性位点Cys^124附近精氨酸突变及功能

为研究人双专一性磷酸酶活性位点Cys12 4 附近 3个带正电的精氨酸对酶催化功能的影响 ,用QuikChange定点突变方法获得 6个突变体 :R12 5L、R130 L、R130 K、R130 L/S131A、R158K和R158L。将含突变基因的重组质粒转化大肠杆菌菌株BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达获得的目的蛋白质均以可溶形式存在。通过镍离子亲和层析纯化得到纯度大于 90 %的蛋白质。对人痘苗病毒H1相关磷酸酶 (VHR)及其突变体进行稳态动力学参数和竞争性抑制常数Ki 的测定 ,结果显示上述Arg130 和Arg158突变体的kcat/Km 值都较野生型有大幅度下降 ,而Ki 值有明显上升 ,表明 130和 15 8位的精氨酸是VHR活性所必需 ,而且可能与底物上带负电的磷酸基团结合有关。另外 ,单突变体R130 L和双突变体R130 L/S131A之间的kcat值相差很小 ,提示Arg130 单点突变后可能破坏了Ser131与Cys12 4 间的氢键。再者 ,R12 5L、R130 L和R158L突变体都降低了砷酸盐结合亲和性 ,暗示这 3个精氨酸残基侧链上的正电荷可能有助于底物与酶的结合。     

慈菇下胚轴毛的形态发育研究

慈菇种子萌发前,下胚轴基部的表皮细胞分化成生毛细胞。当下胚轴穿出种皮约1—2毫米时,生毛细胞的外壁向外突出,形成下胚轴毛。开始时,其顶端膨大,呈分泌毛状,后呈根毛状。下胚轴毛的主要功能是起固着作用。下胚轴毛发育后期,在其保留细胞核的膨大的基部和突起的毛状体之间形成一细胞壁,此时毛状体便开始萎缩脱落。下胚轴毛的基部重新形成完整的表皮细胞。     

慈菇蛋白酶抑制剂中二硫键Cys1~（12）－Cys~（115）功能的研究

慈菇蛋白酶抑制剂中二硫键Ｃｙｓ１~（１２）－Ｃｙｓ~（１１５）功能的研究谢志伟,罗明娟,戚正武（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,２０００３１）关键词慈菇蛋白酶抑制剂Ｂ;二硫键;定点突变;基因表达慈菇蛋白酶抑制剂（ＡＰＩ）与大豆Ｋｕ...     

慈菇（Sagittaria safittifolia）α－半乳糖苷酶的纯化与性质

以对硝基苯糖苷基为底物,测定了慈菇的１２种糖苷酶,其中α－甘露糖苷酶、α－和β－半乳糖苷酶活力较高;经硫酸铵分级沉淀,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０分子筛层析,ＣｏｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ离子交换层析,从慈菇抽提液纯化了α－半乳糖苷酶。纯化酶的比活提高１０７２倍,活力回收１５．６％,在圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上均显示１条蛋白质带,在α－半乳糖苷酶浓度为１５０ｍＵ／ｍｌ的溶液中测不到其他糖苷酶的活力。慈菇α－半乳糖苷酶的分子量用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤柱测定或在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上测定均为６０ｋＤ,酶反应的最适ｐＨ在５．８附近,最适温度为６０℃。该酶分解对硝基苯基－α－半乳糖苷的Ｋ＿ｍ值为３．７×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ,Ｖ＿ｍ值为２．１×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ。银离子、汞离子显著抑制酶活力,Ｄ－半乳糖和密二糖均竞争性地抑制该酶水解对硝基苯基α－Ｄ－半乳糖苷的活力,根据Ｄｉｘｏｎ作图求得其Ｋ＿ｉ值分别为０．９２×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ和１．９８×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ。２－脱氧－Ｄ－半乳糖和Ｌ－岩藻糖为酶活力的非竞争性抑制剂。化学修饰     

慈菇蛋白酶抑制剂A和B中Trp残基周围构象与酶抑制专一性的关系

通过定点诱变结合荧光光谱学方法研究了慈菇蛋白酶抑制剂A和B(APIA和APIB)Trp残基周围构象与酶抑制专一性之间的关系。研究表明APIB中的两个Trp残基 (93和 12 2位 )所处环境的疏水性要比APIA中的强。Trp定点诱变研究表明 ,在APIB中 ,Trp12 2 周围环境的疏水性要比Trp93 强。用Ser和Leu分别替代 82位Leu和 87位Arg ,使APIB中色氨酸荧光特性变得与APIA的基本相同 ,同时还发现其酶的抑制专一性也变得趋近APIA的 ,暗示Trp周围的构象与酶抑制剂的抑制专一性有关。     

慈菇蛋白酶抑制剂对亚洲玉米螟γ-谷氨酰转移酶和氨基酸吸收的影响

正常玉米螟血淋巴内瓣离氨基酸总量为22．32mg／ml。当幼虫短时间(四龄未至五龄第二天)和长时间(三龄初至五龄第二天)取食慈菇蛋白酶抑制剂(AHI)后,游离氨基酸总量分别为对照的73．9％和33．3％,大多数氨基酸含量明显低于对照;血液蛋白质浓度下降20-52%;幼虫体内γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)活力也明显下降,但体外不被AHI抑制。这些结果表明：AHI能有效地抑制幼虫蛋白承解酶．并间接地影响其他酶和蛋白质的生物合成、最终导致幼虫生长不良。     

慈菇属植物的花粉管再分配现象

当花粉落到柱头上,并与柱头识别后,花粉萌发长出花粉管等一系列过程,在被子植物有性生殖中占有很重要的地位。正是由于具备萌发条件的花粉长出花粉管,并产生的雄性配子——精子,然后通过花粉管的伸长生长,被输送到胚珠的胚囊内与卵细胞和极核融合,完成被子植物所特有的双受精过     

慈菇蛋白酶抑制剂对亚洲玉米螟消化酶的影响

亚洲玉米螟幼虫中肠消化酶主要为胰蛋白酶：利用慈菇蛋白酶抑制剂研究它对玉米螟消化酶的影响,发现这种抑制剂体外强烈抑制玉米螟幼虫中肠消化酶：同时我们又比较了长时间取食（三龄至五龄第二天）和短时间取食(四龄未取食48小时)抑制剂的幼虫体内胰蛋白酶活性,当它们短时间取食抑制剂后,体内消化酶水平迅速下降,取食更长时间时,胰蛋白酶活力下降更明显,仅为对照的27．2%。由此可见,慈菇蛋白酶抑制剂严重影响了玉米螟的正常消化,阻断了玉米螟营养与食物间的联系．使玉米螟生长发育不良。     

用激光微束穿刺法将双抗虫基因导入红掌的研究

红掌(Anthurium andraeanum Lind.)是世界名贵花卉,其花独特,佛焰苞艳丽,瓶插寿命长,作为切花栽培有很高的经济价值.慈菇蛋白酶抑制剂是来源于慈菇储藏器官(根茎)的一种天然抗虫物质,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂类,能抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和激肽释放酶,对某些鳞翅目、双翅目以及鞘翅目等昆虫有毒杀作用.通过激光微束穿刺法将构建的含抗虫基因API-A、API-B和选择性标记基因NPT-Ⅱ的质粒pBUBA导人红掌细胞中,通过卡那霉素抗性筛选和聚合酶链式反应(PCR)技术分析表明,抗卡那霉素的绿苗中大部分为阳性植株.     

转Cry1Ac活性杀虫蛋白及慈菇蛋白酶抑制剂B基因的棉花

根据植物基因的结构特征,合成了CrylAc活性杀虫蛋白的编码序列并与内质网定位肽编码序列组成嵌合杀虫蛋白基因Bt29K.构建了含Bt29K基因及慈菇蛋白酶抑制剂B(API-B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体.通过根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens(Smith et Townsend)Conn LBA4404)介导转化了棉花(Gossypium hirsu-tun L.)的两个生产品种(系).根据抗棉铃虫(Heliothis armigera)试验及农艺性状的观察调查结果,经6代筛选,获得了抗棉铃虫90.0%～99.7%且农艺性状优良的9个双价抗虫棉纯合品系.分子生物学分析结果表明,两个抗虫基因在棉花基因组中的插入拷贝数为1个或2个.活性Cry1Ac和API-B蛋白在转基因抗虫棉株系中的表达量分别约占总可溶性蛋白的0.17%和0.09%.对双抗纯合系植株及仅转Bt基因的棉花纯合系抗虫性检测结果表明前者的抗虫性明显高于后者,因此推断本研究采用的双抗虫基因表达载体构建策略是合理的.     

转Cry1Ac活性杀虫蛋白及慈菇蛋白酶抑制剂B基因的棉花

根据植物基因的结构特征。合成了Cry1Ac活性杀虫蛋白的编码序列并与内质网定位肽编码序列组成嵌合杀虫蛋白基因Bt29K。构建了含Bt29K基因及慈菇蛋白酶抑制剂B（API-B）基因表达框的双抗虫基因植物表达载体。通过根癌土壤杆菌（Agrobacterium trmefaciens(Smith et TOwnsend)ConnLBA4404)介导转化了棉花（Gossypium hirsu-tunL.)的两个生产品种（系）。根据抗棉铃虫（Heliothis armigera)试验及农艺性状的观察调查结果。经6代筛选,获得了抗棉铃虫90.0%_99.7%且农艺性状优良的9个双价抗虫棉纯合品系。分子生物学分析结果表明,两个抗虫基因在棉花基因组中的插入拷贝数为1个或2个,活性Cry1Ac和API-B蛋白在转基因抗虫棉株系中的表达量分别约占总可溶性蛋白的0.17%和0.09%。对双抗纯合系植株及仅转Bt基因的棉花纯合系抗虫性检测结果表明前者的抗虫性明显高于后者,因此推断本研究采用的双抗虫基因表达载体构建策略是合理的。