EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。     

小鼠缺氧诱导丝裂原因子基因启动子的结构与功能分析

缺氧诱导丝裂原因子（hypoxia-induced mitogenic factor, HIMF）是一种肺组织特异性生长因子,可刺激肺细胞增生和再生,但HIMF基因表达调控的机制尚未明确．为探索HIMF基因转录调控机制,首先以小鼠基因组DNA为模板,通过PCR扩增方法获得－348～+61 bp、－302～+61 bp、－131～+61 bp、－68～+61 bp的HIMF启动子片段,再将其定向克隆入pGL3-Basic载体,构建荧光素酶报告基因载体,并制备转录因子ETS-1结合位点的突变或缺失体．在阳离子脂质体的介导下,报告基因载体分别瞬时转染正常氧浓度条件下培养的小鼠肺上皮MLE-12和MLE-15细胞、结肠癌CT26细胞．结果发现,各HIMF启动子片段在MLE-12、MLE-15细胞中均有活性,但在CT26细胞中活性缺失;－302～－131 bp区存在HIMF启动子的核心调控元件．针对该区域ETS-1转录因子结合位点进行突变或缺失,能导致HIMF启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明,该区段能结合ETS-1．结果提示,转录因子ETS-1参与正常氧浓度下HIMF启动子活性的调控,为研究HIMF基因的转录调控机制奠定了实验基础．     

儿童孤独症相关基因NRXN1β启动子功能分析

Neurexins是神经特异性突触蛋白,Neurexin1β结构的异常与孤独症密切相关。为分析孤独症相关基因NRXN1β最小启动子和调节基因转录的功能元件,本文构建了含NRXN1β基因上游调控区不同区域的荧光素酶报告基因质粒,转染HEK293细胞后,利用检测双荧光素酶报告基因的转录活性以确定NRXN1β基因最小启动子区,进而筛选出相应的显著增强或抑制报告基因活性的功能区;同时,为鉴定顺式作用元件,利用基因定点突变技术对基因功能区内和临近DNA序列进行连续的碱基突变;最后,采用转录因子预测工具对启动子功能区内的转录调控元件进行分析。结果首次发现NRXN1β最小启动子区位于?88~+156 bp,?88~?73 bp和+156~+149 bp可增强启动子活性,+229~+419 bp可抑制启动子活性,且?84~?63 bp为能够显著性增强启动子活性的顺式作用元件,该区域可能存在DBP(Albumin D-site-binding protein,DBP)和ABF1(Autonomously replicating sequence-binding factor 1,ABF1)两个转录因子结合位点。     

血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建

目的：构建含有不同片段血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的启动子的萤光素酶报告基因载体,并定位缺氧诱导因子1a（HIF-1d）结合VEGF启动子的区域。方法：以VEGF全长启动子为模板,PCR扩增VEGF启动子的不同片段,插入萤光素酶报告基因载体pGL4-basic,确定所扩增的DNA序列后,将其与HIF-1a表达载体共转染293T细胞,定位HIF-1a结合VEGF启动子的区域。结果：测序结果表明扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;萤光素酶活性实验表明,-1128～-728bp片段是HIF-1a与VEGF相互作用激活VEGF启动子转录活性的区域。结论：克隆了VEGF启动子5’端缺失突变体报告基因表达载体,为调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究打下了良好基础。     

人PRL-3基因启动子的克隆及转录因子Snail结合位点的初步鉴定

促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)是重要的肿瘤转移相关基因,其转录调控机制一直未被阐明.应用TRED在线分析系统共获得3种可能的人PRL-3基因启动子区域.通过与人基因组序列进行比对,发现其中3号启动子序列距离人PRL-3基因距离最近,位于该基因上游约1 kb的DNA区域,与5′端非翻译区域邻接.在线Consite分析系统发现,-500 bp至-451bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG.运用分子克隆的方法获得PRL-3基因启动子2段区域-699 bp至299bp及-642 bp至-383 bp区域,后者具有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG.构建具有荧光素酶报告基因的pGL3载体并检测其启动子活性.-699～299 bp区域与-642～-383 bp区域的DNA片段在SW480、SW620、CNE2、293A细胞中均具有启动子活性,其中含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段活性强于较完整的序列.染色质免疫沉淀结合PCR扩增技术及凝胶迁移阻滞实验确定PRL-3基因启动子区域具有Snail结合位点.研究确定,PRL-3基因的启动子位于转录起始位点上游700 bp与下游300 bp的DNA区域,PRL-3基因启动子存在转录因子Snail结合元件.     

NF-κB决定小鼠胎肝激酶-1基因启动子的基本活性

为克隆小鼠胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1,FLK-1）基因上游启动子序列,并观察其不同截短片段在小鼠血管内皮细胞中的启动子活性,以小鼠全基因组为模板,通过PCR扩增方法获得-258～+299 bp、-96～+299 bp、-71～+299 bp、-36～+299 bp大小的FLK-1启动子片段,将其定向克隆入pGL3 Basic,构建荧光素酶报告基因载体,并制备NF -κB结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体介导下,报告基因载体瞬时转染小鼠血管内皮细胞株SVEC 4-10.结果发现,在小鼠血管内皮细胞中,各FLK-1启动子片段均有活性;－71～－36 bp区存在FLK-1启动子的核心调控元件.针对该区域NF-κB结合位点进行突变或缺失,能导致启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明该区段能结合转录因子NF-κB.结果提示,成功克隆了在血管内皮细胞中具有活性的FLK-1上游启动子序列,NF-κB是决定其基本活性的重要转录因子,为进一步研究FLK-1基因的转录调控机制奠定了基础.     

小鼠组蛋白H3K4甲基化酶Smyd3启动子荧光素酶报告载体的构建与活性分析

为研究小鼠(Mus musculus)组蛋白H3 K4甲基化酶基因Smyd3转录调控的分子机制,本研究首先通过PCR的方法克隆了5条不同长度的Smyd3启动子5’端缺失片段,与pMD19-T载体连接后,双酶切克隆入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,构建Smyd3启动子-pGL3-Basic报告基因重组质粒,瞬时转染HEK293细胞48 h后采用双报告基因检测试剂盒检测Smyd3启动子各缺失片段的相对荧光活性.结果表明,本研究成功构建Smyd3启动子5’端缺失片段-pGL3-Basic荧光报告基因重组质粒,所构建的启动子重组子转染组与阳性对照组相比表现出荧光活性,并且pGL3-Smyd3-4的荧光活性最强,是其他的2至4倍左右,pGL3-Smyd3-5的荧光活性最弱.本研究初步确定Smyd3基因的启动子核心区域可能位于-533～-42bp之间,在-2026～-533 bp之间可能存在启动子负调控序列.     

猪ESRRB启动子克隆及其调控活性检测

Esrrb(Estrogen related receptorβ)属于雌激素受体家族,是一类在胚胎早期外胚层细胞中表达并对干细胞多能性维持起重要作用的基因。为了探索猪ESRRB的表达和转录调控机制,克隆了3.3 kb ESRRB启动子片段,构建了相应的报告载体。并将报告载体分别转染293T人胚肾细胞、Hela人宫颈癌细胞和小鼠C2C12成肌细胞。通过TFSEARCH和JASPER方法对ESRRB启动子潜在的转录调控位点进行分析,发现该启动子上有SMAD、STAT3、MYC、KLF4等多能转录因子的结合位点。将相应的转录因子与ESRRB启动子共转染,并检测报告基因荧光素酶的活性。结果显示猪ESRRB启动子具有明显的组织特异性调控,同时SMAD对ESRRB启动子活性有较明显的调控作用。进一步对3.3 kb片段进行了一系列的缺失,发现猪ESRRB核心区域位于5′上游的-25 bp和-269 bp之间。研究结果表明猪ESRRB启动子上潜在的转录因子结合位点及启动子核心区域是参与调控ESRRB表达的重要序列。     

人皮肤成纤维细胞中α1(Ⅰ)前胶原基因转录调控研究

为寻找纤维化形成中调控人Ⅰ型前胶原基因高水平转录的启动序列及其DNA结合蛋白 ,以人皮肤成纤维细胞α1(Ⅰ )前胶原基因转录起始点上游 - 2 5kb至 + 4 2bp的片段为靶序列 ,采用PCR、基因重组、报告基因测活、细胞基因转染技术比较不同长短启动子活性 .凝胶滞留实验 (EM SA)研究高启动活性片段相应的DNA结合蛋白 .基因转染高活性转录因子识别序列至靶细胞 ,探讨前胶原基因激活阻断的新手段 .结果表明 ,- 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp序列具有强启动调控活性 ,而 - 10 5～ + 4 2bp片段启动活性最低 .EMSA对高启动活性小片段DNA结合蛋白的分析提示 ,- 2 6 8～ + 4 2bp序列中存在转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1的特异结合位点 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1至靶细胞可竞争性阻断胶原基因启动转录激活 .研究提示 ,人α1(Ⅰ )前胶原基因 - 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp片段有高启动活性 .转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1与 - 2 6 8～ + 4 2bp序列中相应识别序列的结合与其基础高转录活性有关 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1可从转录水平阻断胶原基因的激活     

人肠组织特异抗原A33基因5′调控区的克隆及其功能分析

用基因组步行法 (genomewalker)克隆了人A33抗原基因的 5′调控区 94 0bp片段 ,并用PCR法鉴定了这一克隆的正确性 .将该序列提交GenBank ,登录号为AF2 0 0 6 2 6 .用引物延伸法 (primerex tension)确定了A33基因的转录起始位点 ,发现该位点位于一个TATA盒下游 10个碱基处 .以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建了不同长度的A33启动子 5′缺失载体 ,用脂质体介导的方法将这些载体转染LoVo、HeLa、2 93等细胞 ,比较了EGFP的表达水平 .研究发现 ,A33启动子上主要转录调控元件以及与组织特异性表达相关的转录调控元件位于A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域     

The cohesin SMC3 is a target the for beta-catenin/TCF4 transactivation pathway

The structural maintenance of chromosome protein SMC3 is a component of the cohesin complex that mediates sister chromatid cohesion and segregation in prokaryotes and eukaryotes. It is also present extracellularly in the form of a chondroitin sulfate proteoglycan known as bamacan. We have found previously that SMC3 expression is elevated in a large fraction of human colon carcinomas. The additional finding that the protein is significantly increased in the intestinal polyps of ApcMin/+ mice has led us to hypothesize that SMC3 expression is linked to activation of the APC/beta-catenin/TCF4 pathway. The immunohistochemical analysis of colon adenocarcinomas from clinical specimens revealed that beta-catenin and SMC3 antigens co-localize with maximal stain intensity within the transformed areas. Cloning and sequencing of 1578 bp of the human SMC3 promoter unveiled the presence of seven putative consensus sequences for beta-catenin/TCF4 binding, two of which are conserved in the mouse Smc3 promoter. Transient transfection experiments in HCT116 and SW480 human colon carcinoma cells using deletion and mutated promoter constructs in luciferase reporter vectors confirmed that the putative sites, the first located at -48 bp and the second located at -701 bp, are susceptible to beta-catenin/TCF4 transactivation. Co-transfection with a beta-catenin expression vector enhanced the promoter activity whereas E-cadherin had the opposite effect. Binding of beta-catenin/TCF4 complexes from SW480 nuclear extracts to these sequences was confirmed by electrophoretic shift and supershift mobility assays. Altogether these results are consistent with the idea that the beta-catenin/TCF4 transactivation pathway contributes to SMC3 overexpression in intestinal tumorigenesis.     

小鼠Lrp5基因启动子的克隆及功能分析

为分析小鼠LDL受体相关蛋白 5 (Lrp5 )基因启动子的结构与功能 ,采用DNA重组技术 ,构建了 7种含小鼠Lrp5基因启动子荧光素酶报告基因表达体系 ,分别为 :pGL3 10 3(- 10 3bp～ + 132bp) ,pGL3 30 3(- 30 3bp～ + 132bp) ,pGL3 4 99(- 499bp～ + 132bp) ,pGL3 70 8(- 70 8bp～ + 132bp) ,pGL3 90 9(- 90 9bp～ + 132bp) ,pGL3 10 34(- 10 34bp～ + 132bp ) ,pGL3 12 2 9(- 12 2 9bp～ + 132bp) .以pRL TK为内参照质粒 ,瞬时转染成骨细胞株 (U2OS )及非成骨细胞株 (COS 7) ,收集细胞测定荧光素酶相对表达活性 .7种荧光素酶表达质粒在 2种细胞中表达无显著差异 ,即在所分析的小鼠Lrp5基因的 136 1bp(- 12 2 9bp～ + 132bp)范围内 ,不存在成骨细胞特异的表达元件 ;而且 7种表达质粒在 2种细胞中呈现相似的变化趋势 ,pGL3 10 3表达活性最高 ,pGL3 12 2 9表达活性显著降低 .表明小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列在 - 10 3bp～ + 1bp范围内 ,- 10 34bp～ - 12 2 9bp之间的 195bp片段内可能含有负调控元件 .     

癌胚抗原(CEA)启动子在肿瘤细胞中的特异表达及介异bak基因诱发凋亡

构建由癌胚抗原 (CEA)启动子控制报道基因增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)表达的重组表达质粒pCEA EGFP .用转染细胞后检测荧光的方法对CEA阳性细胞进行简便、直观的检测 ,并结合流式细胞计数对CEA启动子在人结直肠腺癌细胞LS 1 74T、结肠癌细胞SW 4 80、肺腺癌细胞A5 49、人宫颈癌细胞HeLa和人喉癌细胞HEp 2中的活性进行了分析 ,发现其在SW4 80、LS 1 74T、A5 49中活性较强 ,而在HeLa和HEp 2中无活性 .构建由CEA启动子控制凋亡基因bak表达的重组表达质粒pCEA bak ,转染HeLa及SW 4 80细胞 ,用Hoechst332 5 8染色及PI染色 流式细胞计数分析的方法证明 ,pCEA bak转染能够特异性引起SW 4 80细胞的凋亡 .结果表明 ,CEA启动子具有很好的特异性 ,CEA介导bak基因的方法可望用于CEA阳性癌细胞的靶向性基因治疗 .     

Annexin A3 depletion overcomes resistance to oxaliplatin in colorectal cancer via the MAPK signaling pathway

Colorectal cancer (CRC) is a common disease with high mortality and morbidity. Annexin A3 (ANXA3) belongs to the structurally homologous family of Ca²⁺ and phospholipid-binding proteins. This study aimed to investigate the effects and potential mechanisms of ANXA3 on oxaliplatin (Ox) resistance in CRC. We generated two human CRC cell lines (HCT116/Ox and SW480/Ox) with acquired Ox resistance and determined their resistance properties. ANXA3 expression and cell apoptosis, migration and invasion also were evaluated. We found that cell viability of HCT116/Ox and SW480/Ox was higher than that in parental cells in the presence of Ox. ANXA3 was highly expressed in HCT116/Ox and SW480/Ox cells. ANXA3 downregulation diminished cell survival, migration and invasion, while increased the apoptosis of HCT116 and SW480 with or without Ox. Moreover, depletion of ANXA3 reduced cell viability and BrdU incorporation, increased cell apoptosis and c-caspase 3 expression in HCT116/Ox with or without Ox. A transwell assay determined that knockdown of ANXA3 impeded the migration and invasion of HCT116/Ox and SW480/Ox cells. Additionally, phosphorylation of extracellular signal–regulated kinase (ERK) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) decreased upon ANXA3 depletion in HCT116/Ox cells, and ANXA3 silencing suppressed Ox-induced activation of ERK and JNK signaling pathway. ANXA3 downregulation reduced Ox resistance in CRC, and treatment with the ERK inhibitor PD098059 or JNK inhibitor SP600125 contributed to this process. These results indicate that silencing ANXA3 could overcome Ox resistance in CRC via the mitogen-activated protein kinase signaling pathway.     

小鼠Lrp5基因5′端调控区域的功能

为研究小鼠低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)基因5′端调控序列的功能,PCR扩增小鼠Lrp5基因翻译起始位点上游3041bp(-2909bp~+132bp)DNA序列.PCR产物定向克隆到pGL3-basic载体上,重组质粒命名为pGL3-2909.以pGL3-2909质粒为模板,以不同的引物扩增出不同长短的DNA片段,分别定向克隆到含小鼠Lrp5基因基本启动子并含有荧光素酶报道基因的pGL3-103载体上,构建了12种荧光素酶报告基因表达体系:pGL3-267,pGL3-513,pGL3-535,pGL3-560,pGL3-575,pGL3-623,pGL3-645,pGL3-719,pGL3-770,pGL3-1032,pGL3-1330,pGL3-1619.以pRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7细胞,48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性,pGL3-575(-2909bp~-2334bp)活性是pGL3-513(-2909bp~-2396bp)的20%,pGL3-535(-2909bp~-2374bp)的活性是pGL3-513的44%,pGL3-575的活性是pGL3-560(-2909bp~-2349bp)的48%,均有显著性差异.结果表明,在-2396bp与-2374bp之间的22bp区域内以及-2349bp与-2334bp之间的15bp区域内存在负调控元件.软件分析表明,此区域含有IK2,LYF1及MZF1调控元件.     

大鼠iNOS基因上游调控区在转录激活中的作用

为了探讨大鼠ｉＮＯＳ基因上游调控区不同部位在对细胞因子诱导应答中所起的作用,将调控区不同部位插入ｐＳＶ０－ＣＡＴ报告基因载体,转染体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）,经ＩＬ－１β诱导后,采用氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）活性测定和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交,检查了调控区各部位在ＩＬ－１β诱导ｃａｔ表达中所起的作用．结果表明,被转染的细胞在未经ＩＬ－１β刺激时,各种调控区序列启动ｃａｔ表达的活性均很低．在ＩＬ－１β作用下,调控区远端序列（－１０３７～－４３８）、近端序列（－４３７～＋４６）和全长序列（－１０３７～＋４６）均能独立激活ｃａｔ表达,其中以全长序列的作用最强,表明ｉＮＯＳ基因表达调控区远端和近端序列均具有启动子和增强子样功能．同时证实,远端序列和近端序列单独启动ｃａｔ表达的活性分别为全长序列的９１．３％和６７．１％,揭示大鼠ｉＮＯＳ基因调控区远端序列在介导ＩＬ－１β的应答反应中发挥更重要作用．