血型单克隆抗体试剂稳定剂的研究

为了进一步提高抗A、抗B血型单克隆抗体试剂的稳定性,实验中分别以不同配比的甘油、蔗糖、明胶和EDTA为稳定剂主要成分加入血型单抗试剂,放置在不同条件下观察试剂的稳定性。结果表明,所筛选出的一种稳定剂对血型单抗试剂具有良好的保护作用,试剂在2~8℃条件下放置12个月,凝集效价保持不变,并且该稳定剂对血型单抗的特异性、亲和力、凝集效价和凝集强度均无影响。     

鼠抗人B血型物质单克隆抗体结合部位的特异性

应用ELISA定量结合试验和ELISA定量抑制试验,测定出三株鼠抗人B血型物质单克隆抗体3-3-D9(IgGl),3-5-D12(IgGl)和6-1-G11(IgA)结合部位的结构和特异性。研究发现三株抗B血型单克隆抗体仅结合B血型物质,而不结合A,H和L_e~a血型物质,表现出对B血型的高度特异性。同时这些单抗对B血型物质TijⅡ phenol-insoluble有较高亲和力,与另一B血型物质Beach phenol-insoluble亲和力较低,尽管Beach phenol-insoluble是6-1-G11免疫用抗原。3-3-D9和3-5-D12结合部位互补于含有双分子岩藻糖残基的。这一发现在世界上尚属首次。6-1-G11结合部位互补于含有单分子岩藻糖残基的02E.Glα1。这些单克隆抗体结合部位结构和特异性的揭示,为在临床血液分型试验中广泛应用这些抗B血型单克隆抗体,取代沿用已久的人多克隆抗血清奠定了基础。     

模拟表位结合夹心化学发光法检测抗A和抗B效价

目的:获得A/B血型抗原的模拟多肽,并将其与夹心化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)相结合,以开发更有效的方法来测量A/B抗体的效价。方法:分别用NaM87-1F6和HEB-29对噬菌体12肽库进行三轮淘选。对经酶联免疫吸附实验(ELISA)确定的阳性菌斑进行测序分析,根据其氨基酸组成合成模拟多肽,并通过竞争性ELISA、凝集抑制等方法检测其抗原性。随后将获得的模拟多肽与CLIA结合,检测A、B抗体效价,制作标准曲线以及与现有的微柱凝胶法(CAT)进行相关性对比。结果:经过三轮淘选和相关鉴定后得到13个与抗A抗体和19个与抗B抗体特异性相互作用的噬菌体克隆,其中分别有9个(MTRIQLRMMRLH)和12个(PQMSRHRMRMLP)展示相同的氨基酸序列,据此合成的多肽分别命名为MTR和PQM。竞争性ELISA结果表明,MTR能够特异性拮抗A抗体和A抗原的替代多肽的免疫结合;PQM能够特异性拮抗B抗体和B抗原的替代多肽的免疫结合。凝集抑制实验表明MTR/PQM可以特异性抑制A/B型红细胞与抗A/B之间的相互作用。结合模拟肽的夹心CLIA具有较宽的线性范围(2-2048)和良好的线性相关系数(对于A抗体R~2=0.9566,对于B抗体R~2=0.9762)。基于CLIA方法和CAT测得的抗体滴度结果高度相关(P0.001)。结论:MTR和PQM有良好的A或B抗原性,具有成为其人工替代品的潜能。模拟多肽与夹心CLIA相结合能够实现对A、B抗体滴度的定量检测,且其结果准确可靠。     

抗-D抗体及其应用

Rh血型是仅次于ABO血型系统的人类红细胞抗原系统,至今已发现40多种抗原,但与临床密切相关的是D,C、c、E、e等5种抗原,其中最主要的是D抗原。相应的抗-D抗体无论是在临床输血检测,还是在Rh(D)新生儿溶血病、溶血性输血反应等的防治方面均具有非常重要的意义。传统的抗-D抗体的制备需用人的血清,来源受限。各种抗-D人源性单克隆抗体和基因工程抗体已经成为发展方向。     

免疫磁珠技术分离唾液A/B血型抗原并用于吸附血清A/B抗体

目的:应用免疫磁珠分离技术获得具有良好抗原性的A/B血型抗原,并探究其作为ABO血型抗体吸附剂去除A/B抗体的可行性。方法:将含有血型物质的唾液进行预处理,再与包被了抗体的磁珠混合,分离出纯度较高的A/B抗原,运用酶联免疫及凝集抑制试验验证所得抗原的抗原性及是否存在交叉反应。用未纯化A/B抗原和纯化A/B抗原包被磁珠,对含有抗A/B IgM、IgG的血清进行抗体吸附,用纯化A/B抗原对100份来自O型血孕妇的临床血清样本进行抗体吸附,分别评价其吸附效果。结果:纯化抗原与对应抗体反应后,其吸光度显著高于对照组(A抗原与A抗体0.85±0.12 vs.0.27±0.03,P0.01;B抗原与B抗体0.86±0.09 vs.0.24±0.06,P0.01),与其它类型抗体反应后的吸光度值与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。进行红细胞凝集抑制试验时,纯化抗原可显著抑制相应抗体与红细胞的凝集反应,对其它类型抗体与红细胞的凝集没有抑制作用。血清抗体吸附实验表明纯化抗原的吸附效率比未纯化抗原的高(97.00%vs.88.00%,P0.001)。临床样本抗体吸附实验显示,纯化A抗原对抗A IgM/IgG的吸附效率分别为96.88%、98.44%;纯化B抗原对抗B IgM/IgG的吸附效率分别为96.88%、98.44%。结论:磁珠纯化抗原能特异性地与对应抗体结合,有效吸附血清中的血型抗体,有望作为合成A/B抗原的替代品。     

抗炭疽保护性抗原单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

目的:克隆并分析抗重组炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)单克隆抗体4B2、5E1和2A8轻、重链可变区基因。方法:从分泌抗rPA特异性单抗的杂交瘤细胞株4B2、5E1和2A8中提取总RNA;利用RT-PCR技术克隆抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,并将其连入pMD18-T载体中进行测序分析。结果:4B2VL基因全长378bp,VH基因全长414bp;5E1VL基因全长420bp,VH基因全长426bp;2A8VL基因全长384bp,VH基因全长342bp。通过分析,这些基因均符合小鼠IgGV区基因的特征,含有4个框架区、3个抗原互补决定区,而且抗体特征性的半胱氨酸残基的数量和位置也正确。结论:克隆了抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。     

1939例ABO血型系统新生儿溶血病的血型分布

目的：探讨在母婴ABO血型不合引起的新生儿溶血病（HDN）中的血型分布。方法：对临床表现怀疑为HDN的1939例新生儿进行血清学试验检测,包括新生儿红细胞直接抗人球蛋白试验,红细胞抗体释放试验和游离抗体试验,同时检测母亲ABO血型和RhD血型。结果：1939例婴儿母亲血型均为O型RhD阳性。A型血新生儿818例,其中直接抗人球蛋白试验阳性率17.2%（141/818）,红细胞抗体释放试验阳性率89.2%（730/818）。B型血婴儿1121例,其中直接抗人球蛋白试验阳性率10.9%（121/1121）,红细胞抗体释放试验阳性率78.6%（881/1121）。结论：ABO血型不合引起的HDN中,A型新生儿比B型新生儿患病几率更大。     

ABO血型及其遗传控制

ABO血型的发现（K．Landsteiner,1900）与孟德尔定律重被发现（deVries,Correns,VonTschermak）同年,临床输血配型沿用至今。但对它的研究一直持续到分子生物学时代,可谓是既古老又现代的课题。1ABO血型的分型及其免疫学特征众所周知,ABO血型的分型是根据血液凝集试验确定的。不同型别血液的凝集现象是免疫反应,是细胞表面抗原与异型血清中抗体结合的结果。用以表征其型别的A、B和C（1902年根据LudwikHirszfeld的建议改记作O）源于凝血团的类型编号。红细胞表面具有抗原A的血液称为A型;抗原为B者称作B型;同时具有抗原A…     

O型孕妇产前IgG血型抗体效价与新生儿溶血病的相关性

目的:探讨O型孕妇产前IgG血型抗体效价与新生儿溶血病(HDN)的相关性。方法:选择2013年1月至2015年12月期间,在我院分娩的夫妻ABO血型不合的O型Rh(D)阳性孕妇432例及新生儿为研究对象,观察孕妇血清IgG抗体效价情况,新生儿HDN发病情况,并分析二者相关性。结果:432例孕妇中血清IgG抗A(B)效价大于或等于1:64的有189例,占43.75%,随IgG抗A(B)效价升高,孕妇比例逐渐减少。随孕次增加,孕妇血清IgG抗A(B)效价逐渐增高,各组孕妇血清IgG抗A(B)效价比较有统计学差异(P0.05)。随年龄增加,孕妇血清IgG抗A(B)效价逐渐增高,各组孕妇血清IgG抗A(B)效价比较有统计学差异(P0.05)。随IgG抗A(B)效价升高,HDN发生率显著升高,各组比较有统计学差异(P0.05)。等级相关检验显示,孕妇血清IgG抗A(B)与HDN发生呈正相关(r=0.732,P0.05)。结论:O型孕妇产前IgG血型抗体是引起HDN的主要原因,其水平与HDN呈正相关,值得临床重视。     

血型的分子基础

本文仅就ABO、MN和HLA等血型的结构和功能进行扼要介绍。 (一)ABO血型系统 ABO血型系统又可分为A、B、AB和O型等四种血型。红细胞含A抗原和H抗原的叫做A型,A型的人血清中含有抗B抗体;红细胞含B抗原和H抗原的叫做B型,B型的人血清中含有抗A抗体;红细胞含A抗原、B抗原和H抗原,叫做AB型,这种血型的人血清中没有抗A抗体和抗B抗体;红细胞只有H抗原,叫做O型,O型的人血清中含有抗A抗体和抗B抗体。     

噬菌体呈现技术制备结肠癌抗独特型抗体

 以纯化的鼠抗人结肠癌细胞单克隆抗体 (简称单抗 )MC5与钥孔血蓝素 (KLH)的交联物经腹腔免疫Balb c小鼠 ,取脾分离mRNA .RT PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因片段 (VH 和VLcD NA ,大小分别约为 340bp和 32 0bp) ,二者经linkerDNA连接形成ScFv(singlechainvariablefragment)DNA(约 75 0bp) .将ScFvDNA与噬菌粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13KO7感染后 ,获得重组噬菌体抗体ScFv文库 .以单抗MC5对ScFv文库进行 4轮亲和筛选后 ,随机挑取 80个克隆经酶联免疫吸附实验 (ELISA)筛选出 2 2个呈现ScFv形式抗独特型抗体(抗 IdScFv)的噬菌体单克隆 .竞争抑制实验表明 ,在 2 2个阳性克隆中有 4个克隆所呈现的抗 IdScFv属β或γ型 .针对单抗MC5的噬菌体呈现型抗 IdScFv的制备 ,为筛选新的结肠癌重组抗 Id瘤苗候选分子奠定了基础     

茵陈蒿汤联合西药治疗母儿ABO血型不合疗效分析

目的：评价中西药结合治疗对母儿ABO血型不合的疗效以及新生儿溶血发生与孕次关系的探讨。方法：对314例抗体滴度≥l：64的ABO母儿血型不合孕妇（20-45岁）进行研究,其中246例孕期给予以中西药结合治疗（茵陈蒿汤联合25%葡萄糖液、维生素C、维生素E、苯巴比妥）,68例作为对照,观察孕妇IgG抗A/B抗体效价变化及新生儿溶血发生情况。结果：治疗组抗体效价降低与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）,治疗组新生儿溶血发生率与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。孕次越大,新生儿溶血的发生率越高。结论：中西药结合治疗对降低孕妇IgG抗A/B效价及防治新生儿溶血疗效满意,新生儿溶血发生可能与孕次呈正相关。     

新生溶血病患儿红细胞上致敏抗体对Rh 血型检测的影响

目的:探讨新生溶血病患儿红细胞致敏抗体对其Rh血型鉴定的影响。方法:采用抗球蛋白法、盐水法、微柱凝胶法(Rh血型测定型)、凝聚胺法和抗血清微柱凝胶法(Ig G型)五种方法对近三年来我院收集的163例新生溶血病患儿红细胞进行Rh血型检测,对五种检测结果不一致的患儿红细胞进行0.2 M 2-巯基乙醇抗体放散,比较放散后五种方法检测结果并验证其准确性。结果:29例直接抗体试验阳性患儿的五种Rh血型检测结果不一致,经0.2 M 2-巯基乙醇抗体放散后检测结果均一致。Rh血型准确性验证表明,红细胞放散测定的Rh血型完全符合临床现象。结论:患儿红细胞的致敏抗体达一定数量后,会影响抗球蛋白法、盐水法、微柱凝胶法(Rh血型测定型)、凝聚胺法和抗血清微柱凝胶法(Ig G型)对Rh血型鉴定,0.2M 2-巯基乙醇抗体放散法是一种正确鉴定新生儿Rh血型的简单可行的方法。     

噬菌体肽库筛选抗人B7-H4中和抗体的模拟抗原表位及其免疫原性鉴定

目的:用噬菌体呈现随机12肽库筛选能与抗人B7-H4(h B7-H4)中和抗体特异性结合的模拟抗原表位肽,并用其免疫小鼠检测其免疫原性。方法:以抗h B7-H4中和抗体为靶分子,用体外生物淘洗法从噬菌体呈现随机12肽库中筛选与之结合的噬菌体克隆,用竞争性细胞ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;化学合成候选多肽,并与钥孔血蓝蛋白或破伤风毒素偶联鉴定多肽的特异性;进一步用融合蛋白免疫小鼠检测其免疫原性和抗血清的补体依赖的细胞杀伤活性(CDC)。结果:经过3轮体外筛选后随机挑取50个阳性噬菌体克隆,其中20个克隆与抗h B7-H4抗体有较强的结合能力,DNA测序得到6组结构相似的肽序列;竞争性ELISA结果显示1号肽噬菌体能与细胞表面的h B7-H4竞争性地结合抗h B7-H4单抗;点杂交结果显示1号肽能特异性结合抗h B7-H4单抗;小鼠免疫实验结果显示1号肽融合蛋白能诱导高滴度的抗h B7-H4抗血清,并且抗血清具有补体依赖的细胞杀伤活性。结论:筛选得到能与抗h B7-H4中和抗体特异性结合的12肽模拟抗原表位序列并且具有免疫原性,为进一步开发h B7-H4相关的多肽疫苗提供了实验依据。     

荧光染料R-藻红蛋白标记小鼠抗人CD4单克隆抗体

以R-藻红蛋白(R-PE)标记小鼠抗人CD4单克隆抗体,形成单色或和用其他荧光染料标记的CD系列单抗组成双色、多色的荧光试剂,应用于流式细胞仪检测分析。用异双功能交联试剂SPDP和SMCC分别活化R-PE和CD4单抗,用DTT使经SPDP活化后的R-PE巯基化,再与用SMCC活化的CD4单抗交联。使用NEM终止交联反应,经Sephacryl S-300柱在AKTA FPLC快速液相色谱系统(简称AKTA)监测下分离纯化。结果用R-PE标记的抗CD4单抗,检测正常人外周血淋巴细胞表面CD4抗原的表达,经流式细胞仪(简称FACS)分析表明,R-PE标记的CD4抗体特异性保持完好,荧光强度较高,还可与用FITC标记的其它CD系列单抗配伍成双标或多标试剂。使用SPDP,SMCC异双功能交联试剂和DTT还原剂,成功地偶联了R-藻红蛋白和CD4单克隆抗体,可应用于流式细胞仪检测分析。     

抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。     

自身抗体引起的ABO血型正反定型结果不一致

目的:对因自身抗体引起ABO血型正反定型结果不一致的疑难血标本进行血型鉴定和分析,探讨其原因和解决办法。方法:先用直接抗人球蛋白试验(DAT)和间接抗人球蛋白试验(IAT)确定ABO血型正反定型结果不一致的原因是由于自身抗体的存在,然后做吸收放散试验、抗体筛选试验等排除自身抗体的干扰以便血型的正确判定。结果:ABO血型正反定型结果不一致因自身抗体引起的有10例,其中温抗体7例,冷抗体3例,温抗体同时同种抗体阳性2例,冷抗体同时同种抗体阳性2例。结论:自身抗体会影响ABO血型的正确判定,选用合适的试验进行分析判断以提高血型鉴定的准确性。     

抗CPV-2a单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

犬细小病毒病是危害养犬业的重要传染病之一,患病犬难以治愈.单克隆抗体治疗此病效果明显,本文介绍了制备抗CPV-2a单克隆抗体的方法.用纯化的犬细小病毒(canine parvovirus,CPV) 2a型分离株免疫新西兰大白兔和Balb/c小鼠制备抗CPV-2a多克隆抗体及单克隆抗体.经亚克隆得到1H9、2B5、2B7和2C7共4株单抗,Western blotting鉴定单抗的免疫反应性;间接ELISA方法检测单抗的特异性.为了快速对犬细小病毒病作出诊断,建立了CPV-2a双抗夹心ELISA方法.兔多抗作为捕获抗体,鼠单抗作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统;捕获抗体和示踪抗体最佳稀释度分别为1:800和1:2 000;检测系统最佳稀释度为1:4 000.结果表明:所得4株单抗与pET-32a-VP2蛋白发生特异性反应,且与狂犬病毒(RV)、犬温热病毒(CDV)不交叉反应;建立的双抗夹心ELISA方法对病毒的最低检出量为4.375 μg/mL,与美国RB试剂盒相比,符合率为95%.单抗制备为犬细小病毒病的治疗奠定了基础;双抗夹心ELISA方法的建立为疑似粪便样本提供了简单、快速和可靠的检测手段.     

抗血型物质杂交瘤细胞悬浮培养研究

诱导、选育了适于连续悬浮培养的抗人血型杂交瘤细胞株,并初步建立了一种血型定型试剂悬浮培养生产工艺,抗体效价和亲和力等所有指标均达到或超过国家标准。它是一种经济、简单、切实可行的大生产方法。此外,为用发酵罐大规模生产血型定型试剂提供了物质基础和初步的生产模式。     

一种鉴定MNSs红细胞血型单克隆抗体类型的方法的建立

为鉴定MNSs血型单克隆细胞株6D7C9分泌的抗体类型,通过克隆、亚克隆、细胞转染等分子生物学技术建立了血型糖蛋白GPA、GPB的异源表达系统,并将其作为抗原,通过ELISA、Western 印迹法确定6D7C9分泌的McAb.结果显示,RT－PCR技术成功克隆获得了GPA、GPB血型糖蛋白编码基因,通过分别构建其重组逆转录病毒表达载体pEGZ/GPA及pEGZ/GPB,转染包装细胞293T,再感染L929细胞,经zeocin筛选2周后,RT PCR及流式细胞仪分析证实,L929/GPA和L929/GPB转基因细胞中分别有GPA、GPB目的基因的转录和蛋白表达.用稳定高表达GPA、GPB的转基因细胞通过ELISA和Western 印迹法证实单克隆细胞株6D7C9分泌的是抗GPA/GPB McAb.本研究成功地建立了血型糖蛋白GPA、GPB的异源表达系统,为MNSs血型McAb的检测及GPA、GPB蛋白的功能学研究奠定了基础.