利用多重PCR反应同时筛选番茄Cf-9和Tm-1基因

利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗叶霉病的Cf-9基因和抗番茄烟草花叶病毒病的Tm-1基因紧密连锁的PCR标记进行了同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Cf-9基因紧密连锁的CAPs标记在抗感试材均可扩增出560bp的特异片段,且都存在TaqⅠ酶切位点,抗病基因型酶切后分别产生了450bp、330bp和290bp的不同特异性片段,而感病基因型试材酶切后产生450bp和290bp的特异性片段;与Tm-1基因紧密连锁的SCAR标记为显性标记,只有抗病试材产生750bp的特异片段,不能被TaqⅠ酶切。经反复验证,结果稳定准确,可用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。该体系的建立不仅省时、省工、节省费用,而且可用于苗期辅助选育,加快番茄抗病育种进程。     

由基因序列开发番茄枯萎病抗性基因Ⅰ-2的共显性分子标记

根据I-2的基因序列设计特异扩增引物对I-2/5F和I-2/5R, 扩增I-2基因3 132～3 765 bp之间片段, 基因型为I-2 / I-2的材料03F-7可扩增出633 bp的条带, 而基因型为i-2/ i-2的材料Moneymaker可扩增出693 bp的条带, 杂合型材料可扩增出以上2个条带。通过这两个特异扩增片段的克隆和测序证明, 抗病材料扩增的633 bp片段为I-2基因的3 132～3 765 bp之间的序列, 而感病等位基因中出现大量的碱基突变和60 bp片段插入。利用引物对I-2/5F和I-2/5R, 可区分纯合抗病材料、杂合抗病材料和纯合感病材料, 从而建立了I-2基因的共显性分子标记。在此基础上, 利用该标记对16个主要番茄品种进行基因型鉴定, 8个品种含有I-2基因, 其中1个品种基因型为I-2 / I-2, 其他品种为I-2 / i-2。通过一次PCR和一次HindⅢ酶切建立了I-2和Tm-22双基因检测体系, 为多基因鉴定及标记辅助选择提供了有力工具。     

甘蓝SSR标记在近缘种青花菜的通用性及其应用

本研究对50条甘蓝SSR引物在其近缘种青花菜中的通用性进行了分析,结果表明,38对引物在青花菜上可有效扩增,扩增产物分子量在100～1500bp,有效扩增比率为76%,其中18%具有较好的多态性,揭示了两种作物基因组间存在一定的相似性。同时利用获得的多态性较好的9对引物对青花菜进行基因型鉴定和遗传多样性分析,20份青花菜基因型中共检测到51个基因位点,平均每个引物组合可扩增出5.67个条带,多态性为66.7%。多引物组合可鉴别出所有青花菜基因型。聚类分析结果表明同一来源的基因型间具有相近的遗传基础,且聚类与熟性具有一定的相关性。本研究为今后青花菜种质资源的收集、利用及分子标记辅助育种提供了新的SSR标记和参考。     

由基因序列开发番茄枯萎病抗性基因I-2的共显性分子标记

根据I-2的基因序列设计特异扩增引物对I-2/5F和I-2/5R, 扩增I-2基因3 132～3 765 bp之间片段, 基因型为I-2 / I-2的材料03F-7可扩增出633 bp的条带, 而基因型为i-2/ i-2的材料Moneymaker可扩增出693 bp的条带, 杂合型材料可扩增出以上2个条带。通过这两个特异扩增片段的克隆和测序证明, 抗病材料扩增的633 bp片段为I-2基因的3 132～3 765 bp之间的序列, 而感病等位基因中出现大量的碱基突变和60 bp片段插入。利用引物对I-2/5F和I-2/5R, 可区分纯合抗病材料、杂合抗病材料和纯合感病材料, 从而建立了I-2基因的共显性分子标记。在此基础上, 利用该标记对16个主要番茄品种进行基因型鉴定, 8个品种含有I-2基因, 其中1个品种基因型为I-2 / I-2, 其他品种为I-2 / i-2。通过一次PCR和一次HindⅢ酶切建立了I-2和Tm-22双基因检测体系, 为多基因鉴定及标记辅助选择提供了有力工具。     

甜瓜抗白粉病基因SRAP分子标记筛选

以感白粉病甜瓜A120和抗白粉病甜瓜A119为亲本构建F2代分离群体,采用BSA和SRAP相结合的方法筛选与甜瓜抗白粉病基因相连锁的分子标记.结果显示,294条SRAP引物中有6条引物在抗病与感病池间表现出多态性;对8个高抗和8个高感单株进行扩增,引物me46em51和me3em6分别在高感单株中扩增出210 bp和205 bp的多态性条带,而高抗单株无此扩增带,与抗病、感病池结果一致.采用JoinMap3.0软件进行连锁分析,两标记与抗白粉病基因的连锁距离分别为18.2 cM和23.4 cM,初步推测本实验中甜瓜白粉病抗性为隐性多基因控制.     

由基因序列开发番茄枯萎病抗性基因Ⅰ-2的共显性分子标记

根据Ⅰ-2的基因序列设计特异扩增引物对Ⅰ-2/5F和Ⅰ-2/5R,扩增Ⅰ-2基因3 132～3 765 bp之间片段,基因型为Ⅰ-2/Ⅰ-2的材料03F-7可扩增出633 bp的条带.而基因型为I-2/I-2的材料Moneymaker可扩增出693 bp的条带,杂合型材料可扩增出以上2个条带.通过这两个特异扩增片段的克隆和测序证明,抗病材料扩增的633 bp片段为Ⅰ-2基因的3 132～3 765 bp之间的序列,而感病等位基因中出现大量的碱基突变和60 bp片段插入.利用引物对Ⅰ-2/5F和Ⅰ-2/5R,可区分纯合抗病材料、杂合抗病材料和纯合感病材料,从而建立了Ⅰ-2基因的共显性分子标记.在此基础上,利用该标记对16个主要番茄品种进行基因型鉴定,8个品种含有,Ⅰ-2基因,其中1个品种基因型为Ⅰ-2/Ⅰ-2,其他品种为Ⅰ-2/I*2.通过一次PCR和一次HindⅢ酶切建立了Ⅰ-2和Tm-22双基因检测体系,为多基因鉴定及标记辅助选择提供了有力工具.     

家蚕基因特异性CAPs标记获得及其分子系统学应用

选取家蚕attacin和alpha-amylase基因序列,设计特异性引物,在家蚕品系P50、C108和子一代 (F1) 中扩增。分别采用4种不同的限制性内切酶对扩增产物酶切,最后每个基因都获得了一个CAPs分子标记。依据所得的两个CAPs分子标记对12个品系的家蚕遗传多样性进行了初步研究,构建了其分子系统树。     

基于PCR-RFLP技术鉴定常见食源性致病菌

根据细菌核糖体基因16S rRNA保守端400 bp大小区段特征设计引物,应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法建立一种新型灵敏的食源性致病菌鉴定技术。首先用特异性引物对9属19种细菌基因进行PCR扩增,扩增产物应用7种限制性内切酶Eco52Ⅰ、HindⅢ、MboⅠ、MluⅠ、PstⅠ、SalⅠ和XbaⅠ进行消化酶切,再利用琼脂糖凝胶电泳分辨酶切DNA片段大小数目,分析不同种属细菌酶切产物态型,从而进行基因型鉴别,针对16S rRNA基因片段利用RFLP进行分析,结果表明:19种致病菌表现出10种特异性的RFLP图谱,可准确鉴定区分9属细菌,最低检测限可以达到1 pg/μL。这证明PCR-RFLP技术可用于常见食源性致病菌的快速鉴定。     

两个国内小型猪品种GH基因部分序列的多态性分析

目的对西藏小型猪和广西巴马小型猪生长激素基因（GH基因）部分序列的多态性进行分析。方法采用内切酶ApaI和Hin6I对西藏小型猪（108头）和广西巴马小型猪（132头）GH基因-119 bp～＋486 bp之间的区域进行PCR-RFLPs分析。结果 （1）从ApaI酶切产生的结果来看,ApaI酶切产生A（449 bp＋101 bp＋55bp）,B（316 bp＋133 bp＋101 bp＋55 bp）两种等位基因。等位基因A的频率高于等位基因B,等位基因A为优势基因。AA基因型频率高于AB和BB基因型频率;（2）从Hin6I酶切产生的结果来看,Hin6I酶切产生G1（605bp）、G2（498 bp＋107 bp）、G3（449 bp＋156 bp）、G4（449 bp＋107 bp＋49 bp）四种等位基因。等位基因G4的频率高于等位基因G1、G2、G3。等位基因G1频率很低。基因型G2G3、G2G4、G3G4、G4G4的频率较高。（3）由酶切产生的基因和基因型多态性,发现西藏小型猪与广西巴马小型猪在该基因部分序列差异不显著（P〉0.05）。结论国内的优质实验用小型猪,如西藏小型猪和广西巴马小型猪等位基因A频率均较高。     

小麦Wx-B1基因酶切片段长度多态性及其与直链淀粉含量的关系

采用序列标志位点(sequence-tagged sites,STS)引物,对35个小麦品种的Wx-B1基因位点上的近第4个内含子区域的序列进行了扩增,用限制性内切酶BamHI切割.结果表明,扩增片段有的能被酶切,有的不能.酶切片段出现两种长度多态性,其长度与直链淀粉含量(AC)呈负相关.AC在约20%以上的小麦品种扩增的片段能够被BamHI切割,而在约20%以下的不能.以上结果表明,Wx-B1基因在扩增序列区域有多态性,这可以作为一种分子标记在育种中预测不同小麦品种的直链淀粉含量,以改良小麦品质.     

MTHFR及PAI基因多态性与新生儿早产易感性的关系

目的:探讨MTHFR基因、PAI-1基因多态性与新生儿早产的关系。方法:选自2014年1月-2015年1月期间我院住院患儿285例并分为四组。抽取研究对象静脉血进行目的基因MTHFR基因C677T、PAI基因的提取、扩增及检测。结果:MTHFR基因C677T扩增片段198 bp,经限制性内切酶作用后形成野生CC型(片段198 bp)、纯合子突变TT型(175 bp、23 bp)以及杂合子突变CT型(23 bp、175 bp以及198 bp);PAI基因扩增片段142 bp,经限制性内切酶作用后形成三中基因型,分别为4G/4G型(96 b p、46 bp)、5G/5G型(22 bp、46 bp以及74 bp)以及4G/5G型(22 bp、46 bp、74 bp以及96 bp)。早产儿童与足月儿童MTHFR基因67 7位点T等位基因分布差异显著(P0.05),早产儿童与足月儿童PAI基因启动子675位点4G等位基因分布无显著性差异(P0.05)。结论:早产发生的易感性与多方面因素有关,其中遗传因素方面MTHFR基因677位点T等位基因多态性可能与新生儿早产相关,而PAI基因启动子675位点基因的多态性与新生儿早产的发生无显著相关。     

胆型螺旋杆菌(Helicobacter bilis)的分离、鉴定与序列分析

鉴定分离到的微需氧菌为螺旋杆菌,并对该菌进行分型。小鼠皮下或肌肉注射地塞米松使其免疫抑制,取小鼠肠内容物培养,对分离到的细菌,经油镜,电镜观察,然后提取细菌DNA,用根据螺旋杆菌（Helicobacter sp.)rRNA保守区设计的引物P7/P8进行扩增,并对扩增产物分别用MboI,HhaI,XspI内切酶酶切,酶切产物用10%PAGE分析。再用根据螺旋杆菌胆型（H.bilis)rRNA设计特异引物P7/Pb扩增,将扩增产物测序分析。最后。将该细菌在Scid小鼠上作动物感染。细菌在油镜下呈鸟翼状,电镜下观察到双极鞭毛。无周质纤毛。引物P7/P8扩增出374bp的特异带,此片段能分别被MboI,HhaI,Zsp内切酶酶切,引物P7/Pb扩增出364bp的条带,测得的DNA序列中存在MboI,HhaI,Xsp内切酶酶切。引物P7/Pb扩增出364bp的条带,测得的DNA序列中存在MboI,HhaI,XspI的内切位点,与文献中H.bilis序列比较,同源性为97.5%。动物感染试验符合Koch准则。分离到的细菌确为胆型螺旋杆菌。     

甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-3的ISSR分子标记

以甜瓜抗病资源PI511890和感病自交系‘白皮脆’及其F1、BC1P1、BC1P2、F2群体为材料,苗期接种蔓枯病菌(Did ymella bryoniae)进行遗传分析.结果表明:(1)对甜瓜苗期蔓枯病菌接种鉴定结果显示,抗源PI511890的抗病基因Gsb-3由显性单基因控制.(2)利用集团分离分析及ISSR分析技术,引物ISSR-100扩增出的多态性条带与Gsb-3表现连锁关系,该多态性片段大小为900 bp.(3)统计ISSR-100在182个F2单株上的多态性,并用JoinMap 4.0软件分析结果显示,ISSR-100与Gsb-3遗传连锁距离为8.3 cM,定名为ISSR-100900.研究认为,ISSR100900可作为甜瓜抗蔓枯病分子育种的备选分子标记.     

山西白猪SLA-DQB基因多态性研究

为评价和选育山西白猪提供分子基础数据,采用PCR(polymerase chain reaction)-RFLP(restriction fragment length polymorphism)法对202头山西白猪SLA(swine leukocyte antigen)-DQB基因外显子2的273 bp扩增产物多态性进行研究.山西白猪经HaeⅢ酶切后产生6种基因型:167 bp/23 bp/29 bp/54 bp(AA)、84 bp/83bp/23 bp/29 bp/54 bp(BB)、167 bp/4 bp/102 bp(CC)、167 bp/23 bp/83 bp(EE)、167 bp/23 bp/29 bp/54 bp/4 bp/102 bp(AC)和167 bp/106 bp/4 bp/102 bp(CD);5种等位基因(A、B、C、D和E),其中等位基因A和基因型AA有明显优势.山西白猪SLA-DQB基因外显子2 HaeⅢ-RFLP带型较多.     

特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的方法

利用组织特异性分子标志物启动子调控Cre重组酶,研制了6种在不同组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠.这些转基因小鼠的基因型鉴定均使用设计在Cre基因编码区的通用引物.为了特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶的转基因小鼠,在大鼠胰岛素RIP启动子上和Cre基因上设计1对引物进行PCR扩增,并通过凝胶电泳进行分析.PCR结果显示,设计在Cre基因上的通用引物可以从6种不同组织特异性Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增获得480 bp产物;利用本研究设计的特异性引物可以从胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增200 bp的目的条带.这一结果表明,利用特异性引物进行PCR反应,可有效地将胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠与其他多种组织的Cm重组酶转基因小鼠鉴别开来.     

基于引物扩增受阻突变技术开发水稻耐冷基因CTB4a特异性分子标记

水稻(Oryza sativa)作为热带与亚热带起源的作物对低温敏感.对水稻种质进行耐冷性鉴定,能筛选出耐冷性强的种质,发展耐冷基因分子标记,能够有效鉴别种质中耐冷基因的基因型.本研究使用芽期4℃低温处理10d对41份水稻材料进行芽期耐冷鉴定,对品种的芽期耐冷能力进行评价,获得了参试材料中除了'昆明小白谷'之外的芽期耐冷性最强的品种'南特号'.对已克隆的耐冷基因CTB4a开发分子标记,能够辅助选择水稻的耐冷育种.水稻孕穗期耐冷基因CTB4a来源于'昆明小白谷',能够影响水稻抵抗低温的能力.参照公布的CTB4a序列信息,从中挑选出序列中的作用位点SNP(单核苷酸多态性,single nucleotide polymorphism),结合引物扩增受阻突变技术(Penta-primer amplification refractory mutation system,PARMS),用Primer 6.0设计引物,建立CTB4a基因荧光分子标记GM-CTB4a,使用荧光分子标记GM-CTB4a对41份水稻品种进行鉴定,使用酶标仪在'昆明小白谷'中检测到利用标记扩增产物中包含'昆明小白谷'特异SNP、T碱基引物携带的FAM荧光信号,在另外40份品种的扩增产物中检测到包含作用位点的C碱基引物携带的HEX荧光信号.本研究利用设计的分子标记,鉴定了 41份水稻品种的耐冷性和基因型.比对分析耐冷性和基因型鉴定结果,说明我们开发的分子标记GM-CTB4a特异性较强,具有实际应用价值.研究结果为利用水稻孕穗期耐冷基因CTB4a培育强耐冷水稻品种奠定坚实基础.     

单核苷酸多态性与甜瓜抗枯萎病分子育种研究

目的:结合单核苷酸多态性标记技术,利用甜瓜本身的抗病性以解决新疆甜瓜病害问题。方法:对新疆甜瓜抗枯萎病基因Fom-2基因进行克隆分析,并根据Fom-2基因在不同抗性甜瓜亲本的单核苷酸多态性,设计检测SNP标记的PCR扩增引物,验证其多态性;并利用F2代分析该标记与筛选获得的甜瓜抗枯萎病基因连锁的SSR标记的遗传关系。结果:在抗病与感病甜瓜品种中均扩增获得PCR条带,试验中设计单核苷酸多态性分子标记在抗病品种为显性,与筛选的和抗枯萎病基因紧密连锁的共显性标记SSR430共分离。结论:不同抗性甜瓜品种均含有Fom-2基因或其高度同源序列,SNP显性标记和共显性标记SSR430均可用于甜瓜抗枯萎病分子标记辅助育种。     

高灵敏度电化学发光PCR方法检测基因点突变研究

近年来发展了一种用于定量检测基因点突变的电化学发光PCR方法。该法采用三联吡啶钌标记的上游引物和生物素标记的下游引物对待测基因进行PCR扩增;随后,采用特定的限制性内切酶对扩增产物进行酶切,由于野生型样品和突变型样品间存在酶切位点的变化,其中只有一种基因型样品能被切断;通过生物素与链霉亲和素包被的磁珠连接,将生物素标记的DNA片段收集到样品池中;进行电化学发光检测,通过所得信号的有无可以判断其基因型。我们分别将该法用于Presenilin-1基因和H-ras癌基因的点突变检测,结果均可明显区分突变型样品和野生型样品。该法具有灵敏、快速、简便、安全等优点,是一种实用的基因点突变检测方法。     

rs25754G/A多态性与颈动脉斑块稳定性的关系

为了探讨一种具有玉型血小板反应蛋白的去整合素和金属蛋白酶12 (ADAMTS-12)基因rs25754G/A单核苷酸多态性(SNPs)与颈动脉斑块稳定性的关系,本研究选择78例颈动脉易损斑块患者和101例颈动脉稳定斑块患者作为本次实验的受试对象,应用荧光标记-限制性内切酶酶切法对ADAMTS-12基因rs25754G/A位点进行SNPs基因型检测,运用SPSS16.0统计学软件进行等位基因和基因型频数分布的分析。研究结果显示,颈动脉易损斑块组ADAMTS-12基因rs25754G/A多态位点G+AA基因型和A等位基因频率(98.72%和87.82%)明显高于颈动脉稳定斑块组(90.10%和62.38%)(p0.05)。本研究初步结论表明,ADAMTS-12基因rs25754G/A多态位点与颈动脉易损斑块的发生有相关性。