3-氰基吡啶水合酶的纯化及性质

马红球菌ＳＨＢ－１２１胞内３－氰基吡啶水合酶经硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ＤＥ５２和羟基磷灰石柱层析并经过Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５处理,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的３－氰基吡啶水合酶,纯化了３１倍。该酶由一条肽链组成,棋 分子量为３０ｋＤ,等电点４．１,３－氰基吡啶水合酶能催化３－氰基吡啶水合生成尼克酰胺。酶反应最适ＰＨ为８．０,最适温度为３０℃,Ａｇ＾＋、Ｈｇ＾２＋、Ｃｕ＾     

3-氰基吡啶水合酶的纯化及性质

马红球菌(Rhodococcus equi)SHB-121胞内3-氰基吡啶水合酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-cellulose DE52和羟基磷灰石柱层析并经过Sephadex G-25处理,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的3-氰基吡啶水合酶,纯化了31倍。该酶由一条肽链组成,其分子量为30kD,等电点为4.1。3-氰基吡啶水合酶能催化3-氰基吡啶水合生成尼克酰胺。酶反应最适pH为8.0,最适温度为30℃。Ag~+、Hg~(2+)、Cu~(2+)及NH_4~+对酶活力有强烈抑制作用。当以3-氰基吡啶为底物时,其K_m为0.1mol/L。NaCN为该酶反竞争性抑制剂,其K_I为5mmol/L。     

3-氰基吡啶水合酶的反应条件及影响因子

研究了芳腈水合酶催化水合3-氰基吡啶生成尼克酰胺的反应条件及影响因子.酶反应的最适pH为8.0,最适温度为25℃.酶在pH8.5于25℃保温4小时或在25—30℃于pH8.0保温3小时是稳定的.反应液中加入Fe~(3 )(1.5 mmol/L)可使酶活力增加 50%,而加入NH_4~ (300 mmol/L)则使酶活降低了67%.Ag~ 和 Hg(2 )”强烈地抑制酶反应活性,在浓度均为 5mmol/L时,抑制率分别为99.7%和100%.NaCN(50 mmol/L)和苯甲腈(100 mmol/L)对酶活性的抑制率分别为78%和85%.该酶作用于 3-氰基吡啶的Km为62.5 mmol/L,V_(max)为85.8 μmol·min~(-1)·mg~(-1).     

3-氰基吡啶水合酶的反应条件及影响因子

研究了芳腈水合酶催化水合3-氰基吡啶生成尼克酰胺的反应条件及影响因子.酶反应的最适pH为8.0,最适温度为25℃.酶在pH8.5于25℃保温4小时或在25—30℃于pH8.0保温3小时是稳定的.反应液中加入Fe~(3+)(1.5 mmol/L)可使酶活力增加 50%,而加入NH_4~+(300 mmol/L)则使酶活降低了67%.Ag~+和 Hg(2+)”强烈地抑制酶反应活性,在浓度均为 5mmol/L时,抑制率分别为99.7%和100%.NaCN(50 mmol/L)和苯甲腈(100 mmol/L)对酶活性的抑制率分别为78%和85%.该酶作用于 3-氰基吡啶的Km为62.5 mmol/L,V_(max)为85.8 μmol·min~(-1)·mg~(-1).     

3-氰基吡啶水合酶产生菌的筛选及其酶形成条件

应用富集培养和梯度底物浓度定向筛选技术,从长期被腈化物污染的土壤中筛选到一株产 3-氰基吡啶水合酶(3-cyanopyridine hydratase)活性较高的马红球菌(Rhodococcus e-qui)SHB-121.研究了该菌3-氰基吡啶水合酶的最适形成条件.在最适条件下,酶的比活力达5.3u/mg干细胞,比在初筛条件下的酶活力提高95倍,而在其细胞内共存的尼克酰胺(烟酰胺)水解酶活力很低.     

3-氰基吡啶水合酶产生菌的筛选及其酶形成条件

应用富集培养和梯度底物浓度定向筛选技术,从长期被腈化物污染的土壤中筛选到一株产 3-氰基吡啶水合酶(3-cyanopyridine hydratase)活性较高的马红球菌(Rhodococcus e-qui)SHB-121.研究了该菌3-氰基吡啶水合酶的最适形成条件.在最适条件下,酶的比活力达5.3u/mg干细胞,比在初筛条件下的酶活力提高95倍,而在其细胞内共存的尼克酰胺(烟酰胺)水解酶活力很低.     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究

研究黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性,采用酶学研究方法,通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100纯化了β-葡萄糖苷酶,并进行了黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最适反应温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及米氏常数等特性研究,采用SDS-PAGE凝胶电泳测定了分子量。研究表明,β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃、最适反应pH为4.5;在40、50和60℃下较稳定,80℃以上稳定性差;β-葡萄糖苷酶在pH为3、7、8、9的缓冲液中的稳定性很差,在pH为4、5、6的缓冲液中稳定性较好,其中在pH为5时,稳定性最好;酶的Km=41.67 mmol/L,Vmax=23.81 U/L;其分子量为65.2 ku。β-葡萄糖苷酶在饲料工业具有良好的应用前景。     

立止血的酶学特性及其作用机理

立止血是从蛇毒中分离得到的、以止血作用为主的酶制剂。其中含有两种成分 :巴曲酶 ( Batrox-obin) ,亦称巴特罗酶 ( Batroase)、爬虫酶( Reptilase) ,及微量的凝血因子 脂依赖性激活剂( Phospholipid- depending Factor X Activator,FXA,简称 因子激活物 ) [1,2 ] 。由于立止血具有速效、高效、长效、安全、方便且不受血浆凝血酶抑制剂影响的诸多优点 ,因而广泛用于治疗和预防各种出血性疾病。本文将就其酶学特性及作用机理作一综述。1　酶学特性1 .1　巴曲酶的基本酶学特性　　立止血中的巴曲酶为类凝血酶 ,是单链的糖蛋白 ,可由数…     

一种3-氰基吡啶水解酶产生菌的高通量筛选策略及应用

利用改进的羟肟酸铁分光光度比色法建立了一种简单、快速、高通量的腈水解酶筛选方法.应用该方法从土壤中筛选获得1株具有3-氰基吡啶水解酶活性的菌株CCZU10 -1,经16S rDNA序列分析,鉴定该菌为红球菌属Rhodococcus sp.;同时确定了最适反应温度、pH和金属离子添加剂分别为30℃、7.0和Ca2+ (0.1 mmol/L).在最适催化反应条件下,催化转化50 mmol/L烟腈36 h,烟酸的产率可达到93.5％.     

细菌脱色酶TpmD的酶学特性研究

从嗜水气单胞菌DN322中分离纯化出能够对三苯基甲烷类染料结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿进行高效脱色的脱色酶,命名为TpmD。在测定TpmD分子量、等电点及对不同三苯基甲烷染料脱色的动力学参数、脱色过程对分子氧及NADH/NADPH具有依赖性的基础上,又进一步从黄素FAD/FMN对酶活力的影响、酶抑制剂、酶蛋白N-末端测序及酶溶液的特征吸收光谱等方面对TpmD的酶学本质进行了分析。结果表明,TpmD不含核黄素,其脱色活性也不因加入FAD或FMN而提高。TpmD的N-末端氨基酸序列与多种氧化还原酶具有同源性。甲吡酮及维生素C(Vc)对TpmD的脱色活性具有明显的抑制作用。TpmD酶蛋白的溶液在408nm处有一特征吸收峰,但在连二亚硫酸钠的还原条件下通入CO气体后,该酶却不具有P450酶在450nm处的特征吸收峰。上述结果显示脱色酶TpmD是一种新的氧化酶。     

豇豆几丁质酶部分酶学特性的研究

该文测定了纯化的豇豆几丁质酶部分酶学特性。结果表明,该酶在pH5-8,温度低于60℃的范围内稳定性较好,酶活力最适pH为65,最适温度为50℃。10mmol/L浓度的Hg2 、Mn2 、Mg2 、Co2 等金属离子对酶活力有一定抑制作用,其中Hg2 离子抑制率最高(6883%)。Km(胶状几丁质)值为1662mg/ml;以SDS-PAGE电泳和SephadexG-100柱层析两种方法分别测得分子量为34kD、325kD;IEF电泳测得等电点为83。     

半夏内生真菌所产β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究

从半夏中分离筛选得到一株植物内生真菌,提取培养液中的β-葡萄糖苷酶,研究其酶学特性。结果表明:该菌种所产β-葡萄糖苷酶的最适反应温度在45~50℃之间,最适p H在7~8之间;在低于40℃条件下,p H为6~9时,酶活较稳定;其最适反应时间为40 min,金属离子和有机溶剂对酶活性影响都很大,在最适反应条件下其酶活为(77.83±0.42)U/m L。     

塔格糖-4-异构酶的新酶挖掘及酶学性质研究

d-塔格糖是一种己酮糖,在自然界中天然存在但含量极少,具有降血糖、抗龋齿、改善肠道菌群、促进血液循环和抗衰等作用,可广泛应用于食品、医药和化妆品行业。目前酶催化半乳糖生成塔格糖仅需一步反应,简单易行,但半乳糖较高的成本限制了这一方法的工业应用。果糖是塔格糖的同分异构体,价格低廉,来源稳定,可通过4位差向异构化一步获得塔格糖,是产塔格糖的理想底物。【目的】因此挖掘新的塔格糖-4-差向异构酶对塔格糖的工业生产具有重要意义。【方法】本文通过基因挖掘的手段发现了热袍菌(Thermotogae bacterium)来源的未知功能蛋白(命名为HCZ0)具有塔格糖-4-差向异构酶活性,进而完成了HCZ0的异源表达、纯化及酶学性质表征。【结果】确定HCZ0表观分子量约为57.9 kDa,比活力为0.9 U/mg,最适反应温度和pH值分别为70 ℃和9.0,最适金属离子为Ni²⁺,最适金属离子浓度为2 mmol/L,60、70和80 ℃半衰期分别为180、67和9 h。最适条件下,HCZ0催化200 g/L果糖在2 h内可产生28 g/L塔格糖。【结论】本研究中,HCZ0是碱性高温酶,且具有较好的热稳定性,这些特征在以后的理论研究及工业生产中具有一定的科学价值。     

米曲霉耐热木聚糖酶纯化及酶学特性研究

对米曲霉原始发酵液中耐热木聚糖酶进行纯化和酶学特性研究,利用甘蔗渣为碳源培养米曲霉,通过超滤和阴离子交换柱两步纯化得到木聚糖酶XynH1,分子量35．402kDa,利用飞行时间质谱和SDS—PAGE分析,推断XynH1为XylanaseXynF1,分子量为35．402kDa。XynH1属于糖苷水解酶家族10,酶活为442．2IU／nag,最适pH和温度分别为pH6．0和65℃,80℃以下及pH4．0～10．5范围内较稳定。     

耶尔森氏菌Lip-KM1脂肪酶的纯化及酶学特性研究

从食品冷冻厂样品中筛选得到1株产脂肪酶的低温菌株KM1,经16S rRNA基因序列分析将其初步鉴定为Yersinia enterocolitica的亚种。该低温菌株分泌的胞外脂肪酶Lip-KM1经40%硫酸铵沉淀、超滤浓缩、SephacryTMHRS-100分子筛和Superdex G75凝胶过滤后,得到电泳纯的酶产物,纯化倍数为26倍,回收率为10.3%,相对分子质量约为34.3 kD。在0~25℃和pH 7.2~10范围内均保持良好的催化活性;最适催化温度为37℃,最适pH值为9.0,为典型的低温碱性脂肪酶。     

一色齿毛菌漆酶的酶学特性及染料脱色研究

染料由于具有复杂的化学结构通常难以降解。本文从白腐菌一色齿毛菌LS0547中纯化出胞外漆酶并用于染料脱色实验。SDS-PAGE结果显示纯化的漆酶分子量大小为63.7kDa。漆酶氧化底物ABTS的最适pH为2.2,最适温度为50℃。叠氮钠可强烈抑制漆酶活性,半胱氨酸和二硫苏糖醇可部分抑制漆酶活性。漆酶氧化ABTS,丁香醛连氮和2,6-二甲氧基苯酚的米氏常数分别为0.217,0.306和0.199mmol/L。粗酶和纯化的漆酶用于不同化学结构的染料的脱色研究,结果表明一色齿毛菌纯化漆酶可快速对RB亮蓝进行脱色,偶氮胭脂红和结晶紫的脱色效果低于RB亮蓝,测试的三种染料均可在没有介体存在的条件下被漆酶脱色,显示出一色齿毛菌漆酶在染料废水处理中的应用前景。     

烟草烟酰胺酶基因的克隆及序列分析

烟酰胺酶是烟草中烟碱合成途径中的关键酶之一.在植物中,通过烟酰胺酶的催化作用,烟酰胺转化成烟酸,烟酸是合成烟碱的一个重要底物.从烤烟品种南江3号(Nicotiana tobacum cv.Nanjiang-3)均一化全长cDNA文库中克隆获得烟草烟酰胺酶基因cDNA全长序列(命名为T-nic1),GenBank中的登录号为HQ448853,该基因全长为841 bp.利用ORF finder和ProtParam软件分析显示,它包含一个完整的开放读码框,编码一个含有162个氨基酸、等电点为4.94、分子量为18.2 kD的小分子量蛋白.Blast搜索结果及进化分析结果表明,该基因编码的蛋白与毛果芍药、拟南芥中的烟酰胺酶序列具有较高的同源性,其氨基酸序列一致性分别为71%、67%.     

微生物降解褐煤的酶学机理

褐煤是燃烧值较低的劣质煤 ,工业用途主要是直接燃烧 ,但直接利用伴随着许多环境问题 ,如褐煤燃烧过程中会释放含硫及含氮废气对大气造成污染。自 1982年Ｃｏｈｅｎ和Ｇａｂｒｉｅｌｅ首次报道 2株担子菌Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ和Ｐｏｒｉａｍｏｎｔｉｃｏｌｏｒ能将褐煤转化成黑色液滴[1] 开始 ,许多人开始研究利用生物技术将褐煤转化成洁净、有效的能源或其它生物产品。褐煤是由芳香化环组成并由盐桥、脂肪链等连接起来的大分子网状结构化合物 ,很难进入微生物细胞中 ,所以褐煤的微生物降解是由微生物分泌到细胞外的物质…     

N-酰基高丝氨酸内酯酶的分子改造及酶学特性

革兰氏阴性细菌的群体感应系统利用N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactone, AHL）作为主要信号分子诱导致病因子表达,造成细菌性病害. N-酰基高丝氨酸内酯酶（N-acyl-homoserine lactonase, AHLase）能水解AHL分子的内酯键,减弱致病菌的危害.本研究利用从苏云金芽孢杆菌克隆的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因（auto inducer inactivation A, aiiA）,根据Swiss-model模拟aiiA所编码的AiiA蛋白三维结构,预测可能形成的分子内盐桥、活性中心位点等,利用环状诱变方法对AiiA进行定点突变,以期提高其酶活力和热稳定性等酶学性能.对AiiA及其突变蛋白酶学特性分析结果发现,突变体AiiA-N65K-A206E酶活力要比野生型AiiA-wild提高87.4%,并表现出良好的热稳定性和储存稳定性;37 ℃温浴30 min后酶活力剩余73;9%,比AiiA-wild有了大幅提高;4 ℃储存120 h后酶活力剩余12.9%,而AiiA-wild丧失酶活力.酶动力学分析表明,AiiA-N65K-A206E酶促反应的米氏常数Km为1.23 mmol/L,与野生型相当;最大反应速率Vmax为32.36 μmol/L/min,比野生型有较大提高.本研究表明,利用定点突变技术改造AiiA的分子结构,可有效提升AiiA酶活力、热稳定性和储存稳定性.本研究结果为进一步阐明AiiA结构与功能的关系,促进AiiA在植物病害生物防治上的应用,提供了有益的参考和新的思路.