2型猪链球菌β-半乳糖苷酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的:克隆表达2型猪链球菌β-半乳糖苷酶(BgaC)编码基因,并测定其酶活性。方法:根据05ZYH33基因组序列设计引物,PCR扩增bgaC基因,构建重组表达质粒pET28a-bgaC,转化E.coli BL21,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物通过SDS-PAGE鉴定;最后对表达产物进行亲和层析纯化,获得BgaC纯化蛋白后测定其酶活性。结果:bgaC基因在原核细胞中得到高效表达,重组表达的BgaC分子质量约为69kDa,其酶促反应最适温度为42℃,最佳反应时间为30min,最适反应pH为5.5,最佳底物浓度为10mmol/L。2型猪链球菌BgaC的体外酶活为1615U/ml,酶比活为1076U/mg。结论:2型猪链球菌强毒力株05ZYH33中含有bgaC基因,在原核系统高效表达的BgaC具有良好的酶学活性。     

2型猪链球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的:克隆表达2型猪链球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)的编码基因,并测定其酶活性。方法:根据GenBank中05ZYH33基因组序列设计引物,PCR扩增NagA(SSU05_1259)基因,将其克隆到pET28a载体中,构建重组质粒pET28a:NagA,转化至大肠杆菌BL21,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物通过SDS-PAGE与质谱鉴定;利用Ni亲和层析柱对表达产物进行纯化,获得NagA重组蛋白后测定其酶活性。结果:在大肠杆菌中高效表达了NagA基因,重组表达的Nag A相对分子质量约为43×10~3,其酶促反应最适温度为37℃,最佳反应时间为30min,最适反应pH值为7.5,最佳底物浓度为13mmol/L。2型猪链球菌NagA的体外酶活为124U/mL,酶比活为78U/mg。结论:在原核系统中表达了NagA基因,获得的NagA蛋白具有良好的酶学活性。     

2型猪链球菌磷酸甘油酸激酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的:克隆表达2型猪链球菌中磷酸甘油酸激酶(PGK)并对其酶学特性进行测定。方法:采用PCR方法从05ZYH33基因组中扩增出pgk片段,构建重组表达质粒p ET28a:pgk,经双酶切及测序验证正确的质粒转化入E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,重组PGK蛋白经SDSPAGE和质谱鉴定并测定其酶学活性。结果:PGK在大肠杆菌中可溶性表达,纯化后得到约43k Da的重组PGK蛋白,其酶促反应最适温度为25℃,最适pH为7.5,2型猪链球菌PGK的酶活性为75U/ml,PGK相对于3-PGA的Km值为1.744mmol/L,Vmax为0.143mmol/(L·min),相对于ATP的Km值为2.266mmol/L,Vmax为0.318mmol/(L·min)。结论:利用原核表达系统成功地表达了2型猪链球菌中的PGK,并获得了活性较好的重组PGK,酶学检测发现纯化的PGK具有良好的体外活性,为进一步研究该病在2型猪链球菌致病及代谢机制奠定了基础。     

高致病性2型猪链球菌截短型类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶基因的鉴定和功能研究

【目的】克隆表达高致病性2型猪链球菌05ZYH33株的SspA截短型基因,验证其是否具有酶学活性,并构建该基因的缺失突变株细菌,探讨其在2型猪链球菌致病过程中所起的作用【。方法】构建SS2的SspA截短型基因05SSU0811原核表达质粒,表达并纯化05SSU0811蛋白,运用丝氨酸蛋白酶底物Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(pNa),通过显色反应检测表达产物的酶学活性;运用同源重组技术敲除05SSU0811基因,多重交叉PCR筛选敲除株并测序鉴定,动物试验分析05SSU0811基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】成功表达并纯化05SSU0811蛋白,浓度约为3.5 g/L。丝氨酸蛋白酶活性测定试验证实其具有酶学活性;获得05SSU0811基因缺失突变株,小鼠攻毒试验表明,野生株攻毒的20只小鼠全部死亡,基因缺失突变株攻毒组死亡9只,死亡率45%,两组间死亡率有显著性差异。表明05SSU0811基因缺失的菌株毒力较野生株明显下降。【结论】05SSU0811基因编码的截短型丝氨酸蛋白酶仍然具有酶学活性,SS2的截短型基因SspA在高致病性2型猪链球菌的致病性方面具有一定作用。     

猪链球菌2型烯醇化酶的分子克隆与免疫学特性

对新近测定的猪链球菌2型(S.suis 2)05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析,并与相关家族蛋白进行同源性比较,设计合成引物,PCR法扩增出约1.3 kb的烯醇化酶编码基因(enolase,eno),将其克隆入pMD-18T载体中,进一步亚克隆入表达载体pET32a.将重组表达质粒pET32a::eno转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE初步检测到分子量约为75kD的蛋白带.通过His-Tag亲和层析纯化,获得融合蛋白His-ENO.Western-blot表明该表达产物具有免疫原性.基于ELISA进行的细胞定位实验证实了Enolase可以部分存在S.suis 2 05ZYH33细菌的表面.这提示了Enolase作为一种新发现的抗原对于引发猪链球菌相关疾病可能发挥着重要的作用.     

猪链球菌2型烯醇化酶的分子克隆与免疫学特性

对新近测定的猪链球菌2型(S. suis 2) 05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析, 并与相关家族蛋白进行同源性比较, 设计合成引物, PCR法扩增出约1.3 kb的烯醇化酶编码基因 (enolase, eno), 将其克隆入pMD-18T载体中, 进一步亚克隆入表达载体pET32a。将重组表达质粒pET32a::eno转化E. coli BL21 (DE3), 经IPTG诱导表达后, SDS-PAGE初步检测到分子量约为75kD的蛋白带。通过His-Tag亲和层析纯化, 获得融合蛋白His-ENO。Western-blot表明该表达产物具有免疫原性。基于ELISA进行的细胞定位实验证实了Enolase可以部分存在S. suis 2 05ZYH33细菌的表面。这提示了Enolase作为一种新发现的抗原对于引发猪链球菌相关疾病可能发挥着重要的作用。     

蜂房哈夫尼菌植酸酶基因appA的克隆、表达及酶学性质研究

从蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)中克隆获得一个植酸酶编码基因appA,该基因全长1335bp,编码444个氨基酸,其中前33个氨基酸为信号肽,成熟蛋白的理论分子量为45.2kD。将基因appA克隆到大肠杆菌E.coli表达载体pET-22b( ),并在大肠杆菌中表达,表达产物具有植酸酶活性。对表达的酶蛋白进行纯化,并初步研究了该酶的酶学性质,结果表明:酶的作用最适pH值为4.5;在pH2.0~10.0范围内,酶活性保留80%以上;酶的作用最适温度为60℃;酶的比活性为356.7U/mg,酶动力学分析表明其Km为0.49mmol/L,Vmax为238U/mg;该酶对胰蛋白酶和胃蛋白酶有一定的抗性。该研究为哈夫尼菌属来源植酸酶的首次报道。     

猪链球菌2型的表面蛋白烯醇化酶在细菌黏附和引发免疫下调中的作用

利用克隆表达获得了具有酶活性的猪链球菌2型(S.suis2)05ZYH33重组烯醇化酶(Enolase)蛋白。流式细胞术FCM的细胞定位发现Enolase可部分存在于S.suis205ZYH33细菌的表面。进而利用Hep2细胞探讨猪链球菌表面Enolase参与细菌对宿主细胞的黏附作用。免疫空斑试验的结果提示,Enolase可能作为一个免疫下调蛋白对于引发猪链球菌相关疾病发挥着重要的作用。     

棉铃虫核型多角体病毒sod基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从棉铃虫(Helicoverpa armigera)单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV) C1株基因组中扩增sod基因编码区,克隆到pGEM-T-easy vector,测定了核苷酸序列.将基因编码区克隆到原核表达载体pETblue2,构建了含表达质粒pETblue2/HaSNPV SOD,转化大肠杆菌DE3(BL21)进行IPTG诱导表达. SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细胞总蛋白的37%.邻苯三酚法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物校正酶活力单位为694U/mg.     

猪链球菌2型05Z33强毒株转录调控因子Rgg基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg的基因敲除突变体,观察其生物学性状,并在动物感染实验中比较敲除株与野生株的毒力差异,为进一步研究猪链球菌转录调控因子在致病中的作用提供实验基础。方法:分别以猪链球菌2型05ZYH33基因组和pSET1质粒为模板,扩增基因SSU05_1997两侧各约500 bp的片段为上下游同源臂,氯霉素(Cm)抗性基因为中间片段,采用重叠PCR方法连接3个片段;连接产物先克隆到T载体上,再经过酶切克隆到温度敏感自杀载体pSET4S上;将构建的基因敲除载体pSET4S-1997电转化入05ZYH33感受态细胞,通过改变培养温度筛选出基因敲除突变体05Z33△rgg;对敲除株和野生株的生物学性状及小鼠和猪的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示基因SSU05_1997完全被Cm抗性基因所替代,基因敲除突变体构建成功;05ZYH33△rgg对小鼠和猪的致病性与野生株相比无明显差异。结论:转录调控因子Rgg可能和猪链球菌2型的毒力无关。     

中国甘薯登记品种SSR标记遗传多样性分析

该研究基于TP-M13-SSR分子标记荧光毛细管检测技术,以中国已入库登记的99份甘薯品种为材料,利用SSR标记建立登记品种的“01”数据库,导入DPS软件计算不同品种之间的遗传距离,采用MEGA的邻接法进行聚类分析,并利用Structure混合模型对材料进行遗传结构分析,以探讨各品种的遗传构成以及品种间的亲缘关系,揭示中国甘薯登记品种在DNA水平的相似度,为甘薯品种鉴定、亲本选配和品种改良等提供参考。结果显示:(1)28对引物共扩增出162条谱带,多态率为96.30%,每对引物平均获得5.57条多态性谱带。(2)构建了99份甘薯登记品种的遗传进化树,99份品种的遗传距离在0~0.4646之间,平均遗传距离为0.3077;在遗传距离为0.2670处将99份品种分为3个类群,且同一生态薯区的品种或具有同一亲本的品种首先被聚在一起,但不同生态薯区的品种在各类群中相对分散分布。(3)品种间的遗传基础较窄,部分生态薯区的品种相似性较高;群体结构分析将材料分为3个亚群,与聚类分析分群结果基本一致,其中31份材料拥有混合来源,遗传背景较为复杂。     

外源α-萘乙酸对花期干旱大豆碳代谢的影响

以耐旱性大豆品种晋豆21和干旱敏感性大豆品种徐豆22为试验材料,通过盆栽试验,研究α-萘乙酸(NAA)对花期干旱大豆碳代谢的影响.结果表明:干旱胁迫下,与徐豆22相比,晋豆21净光合速率(P_n)下降幅度较小,光呼吸速率(Pr)和叶片可溶性糖含量增加幅度较小,而叶片蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SS)(合成方向)活性、根系蔗糖含量增加幅度较大.NAA处理提高了干旱胁迫下Pn,并降低了Pr,进而明显缓解了干旱胁迫对大豆植株的生长抑制;降低了叶片淀粉分解酶、酸性转化酶(AI)和SS(分解方向)活性,从而抑制了干旱胁迫诱导的可溶性糖积累;NAA处理也能增加干旱胁迫下叶片SPS、SS(合成方向)活性、根系蔗糖含量、根冠比,表明NAA处理促进了叶片中蔗糖向根系的转运.总之,在干旱胁迫下,外源NAA能够通过调控碳代谢增强大豆植株对干旱胁迫的耐受性.     

脑胶质瘤中心体的异常扩增及其与疾病分期的相关性

目的:探讨脑胶质瘤中心体扩增情况及其与疾病分期的相关性。方法:对40例胶质瘤标本和10例正常脑组织标本进行HE染色的检测;免疫组织化学检测Ki67和γ-微管蛋白的表达;使用免疫荧光染色技术检测中心体扩增情况。结果:不同标本中,HE染色呈现不同的细胞形态特征;Ki67在正常脑组织中没有表达,但在Ⅰ/Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤中的阳性表达率分别为65%、80%和100%,各组间差异具有统计学意义(P<0.01),说明Ki67的表达与胶质瘤级别相关。γ-微管蛋白在正常脑组织和Ⅰ/Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中的表达率分别为30%、50%、80%和100%,各组间差异具有统计学意义(P<0.01),说明胶质瘤级别升高,中心体扩增率增加;免疫荧光检测显示,中心体扩增率和脑胶质瘤的级别呈正相关。结论:中心体扩增是脑胶质瘤的恶性程度的特征之一,并且与胶质瘤发病阶段有关,提示中心体扩增和脑胶质瘤的发展具有密切的相关性。     

江苏奥杜藻属一新变种

本文记述了产自华东地区江苏徐州的一个新变种徐州奥杜藻Audouinella chalybea Bory var. xuzhouensis Hua et Xie.它与原变种的主要区别在于其植物体高达10~20mm;叶绿体不规则片状,周生;单孢子囊常产生于繁殖枝的内侧。     

中华稻蝗两地理种群酯酶特性的比较研究

对采自江苏徐州和山西临猗两个种群中华稻蝗进行了马拉硫磷敏感性的生物测定,同时对两个种群的酯酶特性进行了比较研究。生物测定结果表明,徐州种群的LD₅₀值（13.00 μg/g虫重）是临猗种群（4.64 μg/g虫重）的2.8倍;用对氧磷、马拉氧磷、西维因及毒扁豆碱等四种抑制剂对该两个种群的酯酶的体外抑制研究表明,两个种群所含酯酶大都为B型酯酶;酯酶动力学研究结果表明,徐州种群动力学参数米氏常数（K_m值）和最大反应速度（V_max值）均较临猗种群为高;用α-乙酸萘酯（α-NA）、α-丁酸萘酯（α-NB）和β-乙酸萘酯（β-NA）三种底物测定酯酶活性,在雌性稻蝗中,徐州种群比临猗种群分别高2.02、1.58和1.28倍,雄性中则分别高2.71、1.67和1.33倍;对两个种群酯酶活性频率分布进行比较,徐州种群中酯酶活性高的个体数远大于临猗种群。我们推测徐州种群酯酶的生化特性可能不同于临猗种群,这可能与地理分布、生态环境和食物条件不同有关,杀虫剂选择压力不同可能也起一定的作用。     

A novel Escherichia coli O157:H7 clone causing a major hemolytic uremic syndrome outbreak in China

An Escherichia coli O157:H7 outbreak in China in 1999 caused 177 deaths due to hemolytic uremic syndrome. Sixteen outbreak associated isolates were found to belong to a new clone, sequence type 96 (ST96), based on multilocus sequence typing of 15 housekeeping genes. Whole genome sequencing of an outbreak isolate, Xuzhou21, showed that the isolate is phylogenetically closely related to the Japan 1996 outbreak isolate Sakai, both of which share the most recent common ancestor with the US outbreak isolate EDL933. The levels of IL-6 and IL-8 of peripheral blood mononuclear cells induced by Xuzhou21 and Sakai were significantly higher than that induced by EDL933. Xuzhou21 also induced a significantly higher level of IL-8 than Sakai while both induced similar levels of IL-6. The expression level of Shiga toxin 2 in Xuzhou21 induced by mitomycin C was 68.6 times of that under non-inducing conditions, twice of that induced in Sakai (32.7 times) and 15 times higher than that induced in EDL933 (4.5 times). Our study shows that ST96 is a novel clone and provided significant new insights into the evolution of virulence of E. coli O157:H7.     

甘薯属耐盐植物马鞍藤基因组大小及特征分析

马鞍藤(Ipomoea pes-caprae(L.)R. Br.)是甘薯的近缘野生种之一,为热带、亚热带海滩生长的多年生藤蔓植物,作为沿海地区的园林绿化植物之一,具有较强的耐盐性。马鞍藤基因组学的研究可为耐盐甘薯种质创制提供信息参考。本试验调查了马鞍藤基因组大小和特征概况,为后续全基因组精细图谱绘制打下基础。研究以已知基因组大小的三裂叶薯(Ipomoea triloba L.)为对照,运用流式细胞术对马鞍藤基因组大小进行初步预估;使用二代高通量测序技术(Illumina Hiseq2500)对马鞍藤基因组进行survey评估,测序深度30×,利用生物信息学方法估算马鞍藤GC含量(即鸟嘌呤和胞嘧啶所占比例)、杂合率、重复序列等基因组概况。结果表明:流式细胞术估算马鞍藤基因组大小为1012.704±17.37 Mb;经全基因组Survey测定获得马鞍藤有效数据为21.71 Gb,基因组大小经修正后估算为1041.65 Mbp;通过K-mer分布曲线估算马鞍藤基因组中重复序列所占比率为74.52%,杂合率为0.99%;经初步组装后,GC平均深度及含量分布存在异常,出现分层的现象,这可能与马鞍藤基因组杂合率较高有关。本试验首次报导甘薯属耐盐植物马鞍藤基因组大小及特征信息,为马鞍藤进一步的全基因组深度测序和甘薯耐盐基因挖掘打下基础。     

Vicia root-micronuclei assays on the clastogenicity of water samples from the Kui River near Xuzhou city, People's Republic of China.

The Vicia root-micronucleus (VR-MCN) bioassay was used to determine the genotoxicity of water samples collected from the Kui River near Xuzhou city, China. Results show that all water samples induced elevated MCN frequencies over background. This indicates that the river water was polluted with genotoxic material. The source of pollutants in this river is discussed.     

stx2vha is the dominant genotype of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7 isolated from patients and domestic animals in three regions of China

Shiga toxin-producing Escherichia coli(STEC) O157: H7 strains were isolated from domestic animals and patients from Xuzhou City, Jiangsu Province, China and the bordering Anhui and Henan Provinces and were examined for the stx genotype. Of 390 strains, 277 were identified as genotype stx2vha ; 41, stx2 ; 51, stx2-stx1 ; 1, stx2-stx2vha-stx1 ; 5, stx2-stx2vha ; and 15 were un-typeable. Of the 277 stx2vha-bearing isolates, 116 were isolated from goats; 42, cattle; 38, hens, and 35 from pigs. The study shows stx2vha is the dominant genotype and goats are an important reservoir.     

Seroprevalence of Toxoplasma gondii infection in dogs in Jiangsu Province, eastern China

There is a lack of epidemiological data on Toxoplasma gondii infection in dogs from eastern China. In the present study, serum samples from 288 dogs were collected from Xuzhou, Huaiyin, and Yianchen in Jiangsu Province, eastern China, in August 2010; T. gondii antibodies were assayed by a modified agglutination test (MAT). Antibodies to T. gondii were found in 62 of 288 (21.5%) with MAT titers of 1∶25 in 21 dogs, 1∶50 in 15, 1∶100 in 11, 1∶200 in 6, and 1∶400 and above in 3 dogs. The seroprevalence in ≥3-yr-old dogs was significantly higher (P < 0.05) than that in dogs less than 3-yr-old. The results of the present study indicated that infection with T. gondii in household dogs in Jiangsu Province is a public health concern.