基于重叠延伸PCR构建幽门螺杆菌MreB重组载体

[目的]基于重叠延伸PCR技术,构建串联亲和层析标签(TAP)标记的幽门螺杆菌骨架蛋白Mre B的重组质粒。[方法]将幽门螺杆菌Mre B基因终止密码子TAA前DNA序列(Mre Ba)、TAP和终止密码子TAA后的DNA序列(Mre Bb),通过重叠延伸PCR进行连接,形成大小约3.1 kb的融合片段Mre BCF;Mre BCF片段经XhoⅠ酶切、纯化后,克隆到经SmaⅠ和XhoⅠ双酶切的线性载体p K18mob Sac B上。[结果]PCR、酶切及DNA测序的结果表明,重组质粒p K18Mre BCF包含大小约为740 bp、1 400 bp和1 000 bp的三个片段(Mre Ba、TAP和Mre Bb),并且这三个片段的接头连接及核苷酸序列完全正确。[结论]利用重叠延伸PCR可对多个片段进行无缝连接,简便、高效地构建重组质粒;成功构建了重组质粒p K18Mre BCF,为将来幽门螺杆菌Mre B蛋白功能复合体的分离和鉴定奠定了基础。     

突变质粒CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的构建及表达

[目的]构建CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)真核表达质粒并观察其蛋白表达。[方法]将NotⅠ的酶切位点(GCGGCCGCC)引入第一次PCR的后引物,扩增并突变h PROKR2的1-1035 bp(343YFK/AAA345),再将NotⅠ的酶切位点和3个连续甘氨酸突变碱基GCCGCCGCA引入第二次PCR的前引物扩增并突变h PROKR2的1036-1152bp(351HWR/AAA353),通过NotⅠ酶切位点连接前后两个片段,即可构建pc DNA3.1-h PROKR2-myc-his(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),最后通过测序鉴定突变是否成功。扩增h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),连接入CMV-3flag。Western Blot检测相应蛋白的表达。[结果]成功构建CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)质粒,并验证到相应蛋白表达。[结论]利用NotⅠ酶的碱基序列特性(GCGGCCGCC)进行3个连续氨基酸突变的方法简单有效。质粒CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的成功构建为后期进一步实验创造条件。     

巢式PCR克隆猪T细胞表面抑制性受体PD-1全长基因

为了获得猪T细胞表面抑制性受体PD-1的全长基因,本研究根据猪T细胞表面抑制性受体PD-1的c DNA序列,设计合成2对引物P1/P2、P3/P4,并在P1和P2的5'端分别引入Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点。应用巢式PCR技术从感染猪瘟病毒(CSFV)石门株的猪外周血单个核细胞中,扩增获得了大小为866 bp的基因片段。将扩增的目的基因回收、纯化,克隆至p MD-18 T克隆载体,转化宿主菌DH5α。菌液PCR和质粒PCR选择可疑阳性重克隆质粒,抽提质粒,然后用Eco RⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,最后进行基因序列测定。结果表明,成功构建猪PD-1全长基因的重组质粒(p MD-PD1)。     

一个植物乳杆菌隐蔽质粒的序列分析

[目的]分离植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LP101)中的质粒,并对其序列进行分析。[方法]从植物乳杆菌LP101中提取质粒并行双酶切,纯化后与载体pet22b进行连接,电转化到大肠杆菌DH5α中。将测序后得到的质粒片段进行拼接,对拼接成功的质粒进行序列分析。[结果]从植物乳杆菌LP101中分离得到一个隐蔽质粒p LP101,测序结果显示该质粒大小为3 496 bp,碱基G+C含量为38.2%,编码了一个移动蛋白和一个复制蛋白。BLAST结果显示该质粒的核苷酸序列与干酪乳杆菌(L.casei)中的质粒p SMA23相似性在99%以上。[结论]分离得到了植物乳杆菌LP101中的一个隐蔽质粒p LP101,推定其复制方式为滾环复制,属于滚环复制p C194家族成员。     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

非洲爪蛙prmt5.L基因的克隆及时空表达谱分析

[目的]克隆非洲爪蛙prmt5. L基因并分析其在胚胎发育中的时空表达谱。[方法]收集胚胎,提取总RNA,反转录制备c DNA。设计特异引物,PCR扩增prmt5. L基因的ORF序列,连接到p CS2+载体构建p CS2+prmt5. L重组质粒,连接位点为EcoRⅠ和XhoⅠ。经双酶切和测序验证成功构建p CS2+prmt5. L重组质粒。将p CS2+prmt5. L重组质粒用EcoRⅠ酶切,T7 RNA聚合酶转录获得prmt5. L的反义探针。收集不同时期的爪蛙胚胎,固定并脱水后经原位杂交检测prmt5. L在胚胎发育中的表达情况。通过序列比对和进化树分析PRMT5在进化中的保守性。[结果]成功克隆非洲爪蛙prmt5. L基因,原位杂交检测了prmt5. L在早期胚胎中的时空表达谱。序列比对和进化树发现prmt5. L蛋白在进化中非常保守。[结论]成功构建了p CS2+prmt5. L重组质粒。prmt5. L基因在胚胎发育中呈现动态表达且prmt5. L蛋白在进化中非常保守。     

小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体并鉴定。[方法]通过PCR法扩增出小鼠IL-35基因片段,将其与经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1连接,构建慢病毒重组质粒pLVX-IL-35-IRES-ZsGreen1。用无内毒素试剂盒提取重组质粒后,将其与病毒包装所需的3个辅助质粒共转染到人肾胚(HEK)293T细胞中包装能表达IL-35的慢病毒颗粒。该病毒培养上清经浓缩后,梯度稀释法检测其滴度。用浓缩后的病毒感染HEK293T细胞,然后通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达并结合RT-PCR法检测IL-35基因在该细胞中的表达。[结果]IL-35慢病毒表达载体构建成功,包装的慢病毒滴度为1×109TU/m L,通过荧光显微镜和RTPCR检测发现IL-35在HEK293T细胞中表达。[结论]成功构建IL-35慢病毒表达载体且IL-35蛋白能在HEK293T细胞中过表达。     

幽门螺杆菌Dps蛋白的表达、纯化及活性测定

[目的]表达及纯化重组幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) Dps(DNA protection during starvation)蛋白并测定其活性。[方法]依照Dps蛋白的基因序列,设计PCR引物,并以幽门螺杆菌基因组DNA为模板扩增Dps基因。将扩增产物回收后连接到p ET15b然后转化大肠杆菌,涂布在抗性平板,37℃过夜培养,然后使用PCR和测序验证阳性菌落。使用IPTG诱导重组Dps蛋白表达,并通过Ni~(2+)亲和层析纯化。测试Dps蛋白的亚铁氧化酶活性和抗氧化功能。[结果]通过PCR获得全长为438 bp的Dps基因,成功构建重组质粒p ET15b-Dps,它能编码分子量为18. 9 k Da的重组Dps蛋白。使用IPTG诱导目的蛋白表达,然后纯化得到Dps蛋白。Dps蛋白能够快速催化亚铁离子生成铁离子。与对照BSA蛋白相比,Dps蛋白具有较强的抑制氧自由基生成的活性。[结论]构建了重组质粒p ET15b-Dps,纯化获得Dps蛋白并测定了其亚铁氧化酶活性和抗氧化活性。     

NLRP3基因过表达载体的建立及鉴定

本研究旨在构建携带小鼠nlrp3蛋白的过表达真核载体。首先从高脂饮食喂养3个月的C57BL/6J小鼠上剪取肝脏组织,液氮冻存。快速剪取适量肝脏组织,冰上研磨,Trizol法提取总RNA,逆转录获得c DNA,然后PCR扩增nlrp3基因的编码区。PCR产物电泳回收,经过NotⅠ及NheⅠ双酶切后,将其克隆到真核表达载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP-T2A-Puro中。重组质粒电转进入感受态DH5α,过夜培养后挑取单个菌落过夜扩大培养。然后提取质粒,酶切鉴定后测序。将克隆成功的重组质粒转染HEK293T细胞,培养3 d后收集细胞蛋白,用Western blotting检测nlrp3的表达水平,研究显示,重组质粒p CDH-NLRP3较空白质粒p CDH-NULL的nlrp3蛋白表达水平明显增加(p0.01)。本研究成功构建了nlrp3过表达载体,为进一步研究其作用机制提供了基础工具。     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

水体pH对伪鱼腥藻生长及叶绿素荧光参数的影响

在实验室条件下, 以伪鱼腥藻(Pseudanabaena sp.)为研究对象, 研究了pH对伪鱼腥藻生长、叶绿素荧光参数(Fv/Fm、ETR、Ik)的影响, 以期了解伪鱼腥藻对水体pH的适应及调节能力。试验分为2组, 一组每天测定水体实际pH后调整藻液pH 为初始设定值, 另一组在试验开始时调节pH 至设定值后不人为调节, 每天测定pH。结果表明: 伪鱼腥藻偏好碱性环境, 并对水体pH有很强的调节和适应能力。每天调控pH为11的试验组生长情况最好; 不人为调控pH试验中, pH 5—11试验组pH最终趋于10.9—11.5, 人为调控pH试验中, pH 7—11试验组pH最终趋于9.5—11.3。pH为3和13条件下, 伪鱼腥藻均不能生长。pH 5—11范围内, Fv/Fm、ETR随pH增大而增大, pH 7—11范围内各组Ik值差异不大。     

深圳湾湿地的黑脸琵鹭及其保护

深圳湾湿地是世界濒危鸟类-黑脸琵鹭最重要的越冬栖息地之一。1999-2000年在此越冬的黑脸琵鹭数量178只,约占世界总数量的25%。近十年来深圳湾湿地黑脸琵鹭的数量逐年增加,主要原因可能是由于其它湿地环境恶化而使黑脸琵鹭集中到深圳湾,这种情况对黑脸琵鹭的生存和发展是不利的。深圳湾湿地生态环境存在诸多问题,使该湿地生态系统环境质量不断下降,因此,提出了保护深圳湾湿地生态环境的若干建议。     

深圳地区野生兰科植物资源及其区系特征

通过野外实地调查,结合标本和文献查阅,对深圳地区野生兰科植物种质资源、区系特征等进行研究。结果表明：(1) 深圳野生兰科植物资源共43属75种,以深圳东南部的梧桐山和东部的七娘山较为丰富。其中地生兰28属49种,附生兰13属24种,腐生兰2属2种。(2) 本次调查共发现9个深圳新记录种,其中叉柱兰Cheirostylis clibborndyeri、黄花线柱兰Zeuxine flava为广东省新记录种,二尾兰属Vrydagzynea、地宝兰属Geodorum为深圳新记录属。(3) 深圳野生兰科植物区系以热带成分为主,占非世界属总数的87.5%,温带成分仅占12.5%。(4) 与邻近地区比较,与香港共同属最丰富,有41属,占深圳总属数的95.3%;共有种70种,占深圳总种数的93.3%,具有明显的相似性。     

深圳地铁碳排放量

本文从列车牵引用电和地铁站场用电两方面分析了深圳地铁的碳排放量。首先,计算出深圳地铁2008年牵引用电量为2514万度,2009年为2635万度;地铁站场2008年的用电量为1.08亿度,2009年为1.12亿度。其次,根据南方电网单位电力碳排放量计算出深圳地铁2008年的碳排放量为28053.695吨,旅客人均耗电量为0.984度,旅客人均碳排放量207.025克;2009年为碳排放量28572.561吨,旅客人均耗电量为1.002度,旅客人均碳排放量206.697克。然后,与深圳公交、出租车和香港地铁进行了比较。2008年,由于运量客较少,深圳地铁的旅客人均碳排放量,约为出租车的46%,是深圳公交大巴的1.99倍、中巴的1.26倍。此外,深圳地铁的旅客人均耗电量与香港地铁大致相当,由于香港地铁所用电力的碳排放较低,使得深圳地铁旅客人均碳排放量是香港地铁的1.24倍。最后,对2012年深圳地铁的碳排放进行了预测。结果显示,2012年,深圳地铁的碳排放总量将可能增加9.32倍。客运量约为11.62-7.26亿人次,相应地,旅客人均碳排放量将增加10.86-77.39%。     

药物涂层球囊微粒兔肾栓塞风险的探讨

目的建立体内模型评估药物涂层球囊在动物体内是否有微粒栓塞的风险,探索闭塞血管直径与涂层粒径的关系。方法股动脉入路,用裸球囊封堵腹主动脉远心端,将药物涂层球囊输送至兔腹主动脉,在腹主动脉近心端扩张,随访观察双肾是否有典型血管梗塞的组织坏死现象。结果异常肾主要表现是体积萎缩,表面布满凹坑,粗糙。切片染色发现肾小球充血、无核、细胞核溶解、纤维化、炎性细胞聚集等。肾坏死的病理历程从皮质到髓质,程度与剂量有关,且随时间未见有自愈好转。结论设计的动物模型较灵敏,可以用来评估药物球囊在体内的栓塞风险。     

生态系统生产总值核算制度及管理应用——以深圳为例

“两山”理念提升了我国各级各地政府对生态价值的认识和重视,自然资本核算在全球学界研究及应用已进入新的阶段。如何开展常态化的核算与应用,如何将科研分析转化为管理制度,成为该领域新的研究命题。深圳积极响应中央政府要求,开展生态系统服务价值核算,服务生态治理,在全国（乃至全球）率先制定了第一个政府生态系统生产总值（GEP）核算制度体系。介绍了深圳GEP核算制度体系的建设过程,描述了深圳GEP核算的主要特点,以及"十三五"期间（2016-2020年）深圳GEP试算的结果,讨论了深圳GEP在城市治理方面的应用路径。     

2000-2030年深港景观格局演变时空分异与趋势对比分析

自然气候条件相近但社会经济制度差异显著的深圳与香港为我国制度探索与经济建设提供了重要窗口,两地的景观格局演变规律与发展趋势将深刻影响粤港澳大湾区的生态文明建设进程。以深港两地三期历史土地覆被数据为依据,应用CA-Markov模型预测了2030年景观类型,采用地学信息图谱、景观格局指数等方法对比了深港景观格局的时空分异特征,并通过地理探测器模型、logistic回归模型等方法,探讨了深圳与香港景观格局变化的驱动机制的异同。结果表明：（1）研究期内,深港两地景观格局变化显著,各景观类型之间互相转移频繁。深圳人造地表景观面积将持续增加,而香港则呈现先减少后增加的趋势;（2）深港两地的优势景观类型仍然是人造地表与林地。两地景观形状将趋于简单,相比于香港,深圳景观在呈现较高多样性的同时具有更为破碎化的特点;（3）夜间灯光所表征的经济发展水平对两地人造地表的扩张影响很大。在政策规划、社会经济水平、自然地理条件等多种因素的综合作用下,两地未来景观发展趋同存异。     

Population genetic structure of the tiger prawn (Penaeus monodon) in the coastal waters of South China, based on mitochondrial DNA control region sequences

Genetic variation and population structure of Penaeus monodon in the coastal waters of South China were detected using mitochondrial DNA control region sequences. Eighty individuals were collected at Sanya, Shenzhen, Zhanjiang and Beihai; 69 haplotypes with 157 polymorphic sites were detected. Nucleotide diversity (π) of the combined samples (6.16 ± 3.01%) was much higher than many other species in Chinese seas, such as Penaeus japonicus , Portunus trituberculatus , and Acanthopagrus schlegeli . Genetic differentiation was significant between Beihai and Sanya (pairwise F _ST = 0.09836, P < 0.05), and between Beihai and Shenzhen (pairwise F _ST = 0.12153, P < 0.05). Significant genetic differentiation among all populations was found by analysis of molecular variance ( amova ) ( F _ST = 0.053, P = 0.037 < 0.05). The upgma dendrogram of the four populations showed Sanya and Shenzhen as the closest to each other, with Beihai having the greatest genetic distance from Sanya and Shenzhen. The tiger prawn of the coastal waters of South China should therefore be bred as two separated stocks, avoiding inbreeding or outbreeding selection of P. monodon in the captive breeding program. According to our results one source population is Beihai, and the others are from Sanya and Shenzhen.     

2000—2018年深圳市植被覆盖动态变化与预测

采用Landsat系列多时相影像数据,以像元二分法估算植被覆盖度,运用线性回归分析、重心迁移等方法来探究深圳市2000—2018年植被覆盖的时空变化特征,并结合CA-Markov模型对深圳市未来土地覆盖情况进行预测。结果表明: 2000—2018年,深圳市植被覆盖呈明显的地域分异特征,在区域上表现为东部大于西部、南部大于北部,此分异特征与区域地形效应具有良好的一致性。植被覆盖度重心的空间迁移特征为西北-东南-西北,迁移速率为551.2 m·a^-1,此进程与深圳市城市化进程密切相关。2000—2018年间,深圳市植被覆盖度总体呈改善趋势,改善速率为0.005·a^-1,其中,植被覆盖度显著改善和退化的面积比例分别为30.8%和12.8%。采用CA-Markov方法分理论、自然两种情景对深圳市2024年土地覆盖/利用类型进行预测,两种预测方法所得土地覆盖/利用类型的面积所占比例之间没有显著差异,其差异阈值在0~1.2%。与2018年之前相比,2024年深圳市乔木林、耕地等转化为建设用地的比例将明显减少,但供需矛盾仍然紧张。     

Natural Estrogens in the Surface Water of Shenzhen and the Sewage Discharge of Hong Kong

Despite the fact that estrogens cause hormonal disturbances in aquatic organisms, few studies on the estrogen contamination in our surface waters have been conducted. This study was thus conducted (1) to investigate the level of estrogens in the surface waters in Shenzhen and (2) to examine the estrogen levels in the sewage discharges in Hong Kong. Total estrogens (estrone E1, estradiol E2, and estriol E3) in the samples taken from two reservoirs, five rivers, and thirty sampling locations of the seawater in Shenzhen were measured by using ELISA kits. The preliminary results have revealed that the level of estrogens in the surface waters of Shenzhen is generally higher than that in the similar water bodies in well-developed nations. Sewage could be the major source of the estrogen contamination in these waters. The total estrogens levels in the Xili and Shenzhen Reservoirs were in a range of 3–11 ng/L with a mean value of 7 ng/L, where that in four rivers in Shenzhen were found to be 47–90 ng/L and 60.25 ng/L, respectively. In the seawater near the sewage discharge points they were 260–300 ng/L and 287 ng/L, respectively. The estradiol levels in the influent and effluent of three sewage treatment works (STWs) in Hong Kong were also monitored. The activated sludge process used in these STWs removed more than 80% whereas the chemical coagulation processed used at the Stonecutters Island STW removed less estrogens. Biological treatment appears to play a significant role in removing estrogens from wastewater.