新型人血清白蛋白特异结合肽ML的筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术筛选和鉴定新型人血清白蛋白(HSA)特异结合7肽,分析与垂体腺苷酸环化酶激活肽27(PACAP27)构成的融合多肽ML-PACAP27与HSA的亲和结合力,以确定筛选的7肽(ML1和ML2)在与其他药物多肽或蛋白融合状态下仍具有较高的HSA结合活力。利用噬菌体展示7肽库,经四轮筛选、筛选克隆的DNA测序、酶联免疫吸附技术分析(ELISA)初步鉴定筛选克隆与HSA的亲和作用,并利用等离子共振技术(SPR)定量测定合成的ML-PACAP27融合多肽与人血清白蛋白的亲和力常数。实验结果表明:经筛选获得2个与人血清白蛋白特异性结合的7肽序列,其氨基酸序列分别为:ML1:LKSCKPL和ML2:SLKSHAL;ELISA分析结果显示,含有ML1和ML2的噬菌体均可亲和结合HSA,而且ML2的亲和结合作用高于ML1;SPR分析结果显示,ML1-PACAP27和ML2-PACAP27与HSA的解离常数(KD)分别为:8.1×10-6mol/L和3.7×10-6mol/L,ML1-PACAP27与HSA的结合力高于ML1-PACAP27。筛选和鉴定了两个可与HSA特异性结合的7肽序列,该7肽序列可用于特异偶联HSA的长效分子药物的重组融合表达或设计,可为延长分子药物的半衰期及新型药物研发提供新工具。     

神经元蛋白3.1结合蛋白的筛选与鉴定

哺乳动物肺组织发育的基本模式总体分为上皮分支的形态发生和分隔膜的形成两个部分．基因p311是克隆到的一个在分隔膜形成阶段特异表达的基因,可能在肺泡发育中起重要作用．为进一步探讨神经元蛋白3.1(P311)对肺发育过程的影响,构建了小鼠肺组织 cDNA文库,以融合Gal4 DNA结合结构域的重组P311蛋白为诱饵,利用酵母双杂交技术从文库中筛选P311结合蛋白．通过免疫共沉淀和双分子荧光互补等技术进一步验证, SPARC(secreted protein, acidic and rich in cysteine)被确定为P311 相互作用蛋白．进一步的研究发现,SPARC在肺组织中具有与P311相似的表达时序特征,双重免疫组织化学染色显示SPARC和P311在小鼠肺组织中共定位于肺泡上皮细胞和肌成纤维细胞中．提示P311可能通过与SPARC的相互作用影响肺泡发育．     

EpCAM分子特异结合多肽的筛选和鉴定

上皮/内皮细胞分子(EpCAM)是癌干细胞(CSC)重要的表面标记物分子.利用噬菌体展示肽库进行亲和消减富集生物淘筛(Biopanning),经过5轮淘筛,从最后一轮的噬菌体洗脱库中随机挑选47个克隆扩增,通过ELISA方法初步确定30个阳性噬菌体克隆并进行测序,序列分析后获得5个共有序列克隆群,随后通过细胞免疫荧光实...     

Vasorin蛋白特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别vasorin(VASN)蛋白的单链DNA(ss DNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用SPRSELEX技术筛选VASN蛋白特异ss DNA适配体,通过基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure软件分析富集文库序列并挑选出候选适配体序列,利用EMSA、ELISA、流式细胞术对候选适配体进行特异性与亲和力鉴定。结果:经过5轮SELEX筛选,获得了与VASN蛋白特异结合的ss DNA适配体富集文库,合成候选适配体,经EMSA和ELISA检测分析,证实适配体V4-2能与VASN蛋白特异结合,而不与无关对照牛血清白蛋白结合,其平衡解离常数为281.3±103.7 nmol/L;流式细胞术证实V4-2能够特异识别高表达VASN蛋白的Hep G2细胞。结论:筛选获得特异识别VASN蛋白的ss DNA适配体V4-2。     

肿瘤及胚胎组织特异表达蛋白CEP65相互作用蛋白的筛选与鉴定

CEP65蛋白(cancer and embryo expression protein 65)为肿瘤单克隆抗体3H11所识别的抗原分子, RT-PCR及RNA印迹检测表明, CEP65蛋白表达于肿瘤及胚胎组织.为了研究CEP65在肿瘤发生中的作用机制,以CEP65为诱饵蛋白,通过酵母双杂交体系筛选人胚胎组织cDNA表达文库. 从5.2×10⁶个克隆中筛选得到14个阳性克隆,并在酵母体系中通过不同方法得到验证.在此基础上,选取在双杂交中作用明显的51号克隆,与CEP65作GST pull-down实验, 结果证明, CEP65与51号阳性克隆蛋白确能相互作用. 生物信息学分析发现, CEP65与51号阳性克隆蛋白相互作用, 可能通过WW结构域或者蛋白激酶C对细胞的增殖与分化起到调节作用.     

人巨细胞病毒UL55编码蛋白结合蛋白的筛选与鉴定

从人胎脑c DNA文库中筛选和鉴定出与人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)UL55编码蛋白结合的蛋白。将UL55基因编码区克隆到诱饵载体p GBKT7中,在证实UL55蛋白不具有自激活作用的前提下,采用Match-maker GAL酵母双杂交系统筛选人胎脑c DNA文库中与UL55蛋白结合的宿主蛋白,用酵母双杂交回转实验验证UL55蛋白与获得的蛋白结合的可靠性。将酵母双杂交筛选出的文库蛋白烯醇化酶1(enolase1,ENO 1)构建到p GEX-4T-2载体上,利用GST pull-down技术体外验证ENO 1与HCMV UL55蛋白的结合。并依据所筛选出蛋白的生物学功能分析UL55蛋白可能的生物学功能。结果显示有10种蛋白与HCMV UL55编码蛋白结合。应用GST pull-down技术检测到ENO 1与HCMV UL55相互结合的蛋白条带。成功地筛选出10种与UL55蛋白相互结合的宿主蛋白,GST pull-down实验进一步表明ENO 1可以与HCMV UL55蛋白直接结合,为进一步研究UL55蛋白的功能提供了新的线索。     

转录因子X-box结合蛋白1相互作用蛋白的筛选和鉴定

X-box 结合蛋白 1 是一种重要的转录因子,参与体内多项信号转导过程. 为进一步研究 XBP1 的生物学功能,运用酵母双杂交技术在肝细胞文库中筛选 XBP1 的结合蛋白. 首先运用 PCR 技术扩增获得 XBP1 的编码序列,克隆至 pGEM-T 载体,经测序鉴定后,亚克隆至诱饵载体 pGBKT7 中,转化酵母 AH109(a type). 免疫印迹检测诱饵质粒 pGBKT7-XBP1 在AH109 酵母中的表达之后,含有诱饵质粒的酵母 AH109 与含有肝细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母 Y187(αtype)配合,配合后的二倍体酵母生长在含有 X-α-gal 的营养缺陷型培养基上 (SD/-Trp-Leu-His-Ade) 进行选择和筛选,经测序和序列比对确定阳性克隆的开放读码框 ORF,得到 7 种不同的蛋白质. 为了进一步验证这些筛选蛋白质与 XBP1 的相互作用,克隆其中一种蛋白质 MT1E,并运用 GST pulldown 和免疫共沉淀技术成功检测了 MT1E 和 XBP1 的相互作用(体外 / 体内),结果提示,MT1E 可能是 XBP1 的一个新的调节蛋白. 通过酵母双杂交技术筛选得到的 7 种蛋白质分别与肝细胞基础代谢、蛋白质的合成与运输、细胞的增殖与凋亡密切相关. 上述结果有助于揭示 XBP1 的生物学功能,为进一步探讨 XBP1 的表达和调控机制提供新线索.     

大鼠成骨细胞特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别大鼠成骨细胞的单链DNA(ssDNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用完整细胞为靶标的消减细胞SELEX技术筛选大鼠成骨细胞特异ssDNA适配体,通过荧光显微镜、流式细胞术、基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure分析软件,分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过6轮消减细胞SELEX筛选,荧光显微镜鉴定文库已富集;通过流式细胞术检测及测序分析,得到2条适配体L54和L66与大鼠成骨细胞特异结合,其平衡解离常数分别为494.4±133.3和511.4±160.7 nmol/L。结论:筛选获得特异识别大鼠成骨细胞的ssDNA适配体。     

水稻种子发育期间特异锌指蛋白基因的筛选与分析

.锌指蛋白基因是植物基因组中最大最复杂的基因家族之一.大部分的锌指模体存在于转录因子中,它们在转录水平上参与植物生长发育及植物对生物和非生物胁迫的反应.为了解锌指蛋白基因在水稻种子发育中的作用,本研究通过多种数据库搜索获得了878个水稻锌指蛋白基因.从中选取311个利用RT-PCR技术分析它们在水稻成熟期根、茎、叶、花及不同发育阶段种子中的表达特征.结果发现,共有196个基因能在至少1个水稻器官中表达,其中10个为种子特异性表达基因.进一步分析发现,10个特异表达基因在水稻种子不同发育阶段中的表达具有种子阶段表达特异性.同时分析它们的基因及蛋白结构特点,结果显示它们的结构较简单,其中3个蛋白含有线粒体靶肽,5个蛋白含有CCCH锌指结构域.另外,分析种子特异性表达基因上游调控区的顺式作用元件,结果表明它们都含有TATA-box、CAAT-box和种子特异调控元件,除此之外还发现了光、激素和胁迫反应相关调控元件.这些结果为进一步研究它们在种子发育过程中的生物学功能提供了有用的线索.     

一种结合SELEX与二代测序技术筛选RNA结合蛋白特异识别序列新方法的建立

RNA结合蛋白通过特异识别RNA底物发挥重要的生物学作用。指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术是一种体外筛选核酸底物的基本方法,SELEX技术通过重复多轮筛选从随机核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸底物,本研究将利用该技术与二代高通量测序(NGS)相结合,体外合成含有20个随机碱基的RNA文库,将所要研究的蛋白构建到带有可被链亲和酶素磁珠捕获的SBP标记的载体上去,显著提高筛选效率,仅需1轮筛选即可获得所需RNA底物motif。通过该方法获得了人的hn RNP A1的UP1结构域特异识别AGG和AG二种RNA序列,并通过EMSA实验证实其可以与获得的RNA motif结合。这一方法的建立对于研究RNA结合蛋白识别底物的序列特异性,并进一步了解其在生物体内的调控机制有重要意义。     

早期胃癌血清特异标志物过氧化物酶4核酸适配体的筛选、鉴定与应用

胃癌是世界上死亡率第三的重大疾病,而在早期阶段却有着良好的治愈率和生存率。因此,找到针对早期胃癌的特异性标志物从而提高早期胃癌的检出率,是目前亟待解决的问题。在本实验室的早期研究中,发现过氧化物酶4（peroxiredoxin-4,PRDX4）有极大的潜能作为早期胃癌的特异性标志物,并且由于蛋白质结构的特殊性,能够分泌至血清中,为早期胃癌的无创化诊断提供了可能。本文为寻找血清中PRDX4蛋白的特异性适配体,通过消减-SELEX方法找到9种适配体。经特异性和亲和力分析后,证实其中Ap-EGACS-11在9种适配体中具有最高的特异性和亲和力。随后在适配体的验证研究中证实,相对于进展期胃癌病人血清、结直肠癌病人血清和正常人血清,Ap-EGACS-11对早期胃癌病人血清的检出率最高。该结果表明,PRDX4具有早期胃癌特异性血清标志物的潜能,且Ap-EGACS-11可直接作为早期胃癌的检测试剂。     

利用噬菌体抗体库筛选U251细胞血清应答基因蛋白特异抗体

利用噬菌体表面展示抗体库对不同血清处理U251细胞吸附的抗体进行差异筛选,筛选获得血清饥饿细胞吸附的阳性噬菌体克隆96个和血清饥饿后恢复血清培养细胞吸附的阳性噬菌体克隆82个。细胞免疫组化检测发现应答反应差异较大的抗体2个,即血清饥饿培养细胞特异反应的抗体1个（11号抗体）和血清饥饿后恢复血清培养细胞特异反应的抗体1个（2号抗体）,其中2号抗体在恢复血清培养细胞中的应答反应强于血清饥饿培养细胞,是一个血清应答基因蛋白特异抗体,且在血清饥饿后恢复血清培养不同时间的U251细胞中具有一定的特异性反应。该研究为寻找与细胞周期调控有关的因子奠定了基础,同时对肿瘤的诊断和治疗研究也有重要意义。     

AtSARK互作蛋白的筛选与鉴定

植物LRR型类受体蛋白激酶在植物生命活动中发挥着重要作用。前期研究发现了一个通过生长素和乙烯的协同作用参与拟南芥叶片衰老过程正调控的类受体蛋白激酶, AtSARK。为深入研究 AtSARK 蛋白的作用机制, 文章采用酵母双杂交系统, 以AtSARK胞内域（AtSARK-CD）为诱饵蛋白, 对拟南芥均一化cDNA文库进行筛选, 得到83个AtSARK的候选互作组分, 经过复筛, 初步发现AtSARK的互作组分包括14-3-3蛋白、FKBP-型肽脯氨酰顺反异构酶、醛缩酶超家族成员、RING/U-box 超家族成员以及WRKY转录因子家族成员。我们对其中一个功能未知的醛缩酶家族基因AtFBA5 （AT4G26530）的表达模式进行了分析, 并用GST pulldown实验证实了AtSARK-CD与 AtFBA5间存在直接的相互作用。At-SARK互作组分的文库筛选及AtFBA5的分离有利于进一步研究 AtSARK 基因在衰老信号通路中的作用机制。     

槟榔核心资源品质鉴定和特异种质筛选

为培育槟榔(Areca catechu)优良新品种,对10份核心资源品质进行鉴定和相关性分析.结果表明,不同种质资源的品质性状存在显著差异,9个性状的变异系数为7.00％～190.13％,其中,表儿茶素含量的变异系数最大,鲜果横径的最小.相关性分析表明,鲜果纵径与槟榔碱含量呈极显著正相关,与没食子酸含量呈显著负相关.基...     

宿主细胞内SARS-CoV N蛋白相互作用蛋白的筛选与鉴定

SARS-CoVN蛋白可与病毒RNA形成复合物,也可与病毒或宿丰细胞中多种蛋白质相互作用,影响宿主细胞的多个信号转导通路,干扰宿主细胞的细胞周期,从而改变宿主细胞的生命活动.利用酵母双杂交技术筛选了15个宿丰细胞内与SARS-CoVN蛋白的相互作用蛋白,其中包括信号传导组分7种,蛋白激酶3种,细胞因子2种,未知功能蛋白3种.并利用免疫共沉淀方法进一步证实了趋化因子CXCL16是宿主细胞与SARS-CoV核衣壳蛋白的相互作用蛋白.     

猪鼻支原体P37蛋白相互作用蛋白的筛选与鉴定

既往工作表明,胃癌组织中有较高的猪鼻支原体感染率,猪鼻支原体的主要膜蛋白P37能够诱导外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子（TNF）.为了深入研究P37的作用机制,利用酵母双杂交系统筛选与P37蛋白相互作用的蛋白质分子.首先,将编码P37全长的cDNA克隆到pGBKT7载体中,构建“诱饵”表达载体pGBKT7-p37,以此筛选人胎盘组织cDNA表达文库.在2.6×10⁶个克隆中,筛选到一株能与P37相互作用的阳性克隆,序列测定表明,该阳性克隆编码人视网膜色素上皮细胞蛋白（Norpeg蛋白）.在此基础上经GST-Pull Down实验,进一步证实Norpeg蛋白确能与P37相互作用,为进一步研究P37对细胞的作用机制奠定了基础.     

基于凝集素-糖蛋白特异结合的特性筛选与鉴定空肠弯曲杆菌NCTC11168株糖蛋白

[目的]从空肠弯曲杆菌NCTC11168菌株中筛选糖蛋白.[方法]本实验基于凝集素-糖蛋白特异结合的特性,先用免疫印迹的方法确定空肠弯曲杆菌内糖蛋白能与凝集素SBA特异结合,再用包被有凝集素SBA的磁珠捕获样品中的潜在糖蛋白,通过N-乙酰半乳糖胺竞争性洗脱及双向电泳分离,最后利用串联质谱鉴定捕获的糖蛋白.[结果]质谱分析共鉴定到22种空肠弯曲杆菌蛋白,其中至少5种为已报道糖蛋白,包括Cj0633在内的17种为迄今为止未知的潜在糖蛋白.[结论]这种糖蛋白筛选策略可用于细菌糖蛋白的分离鉴定.     

mPem蛋白相作用分子的筛选与鉴定

mPem是同源异型框基因,其C末端编码同源异型域。为进一步研究mPem蛋白在胚胎发育和生殖组织发育过程中的作用,利用GAL4酵母双杂交系统筛选小鼠7d胚胎cDNA文库,共获得3个与mPem蛋白相作用的分子。其中之一为Mdfic,一种新的转录调控因子。进一步的酵母双杂交和体外GST_Pulldown试验再次确认两者之间的相互作用。Mdfic与mPem蛋白之间的相互作用暗示两者有可能组成转录调控复合体,共同参与胚胎分化的调控,为两种蛋白功能的研究提供新的思路。     

IEX-1相互作用蛋白的筛选与鉴定

骨肉瘤即原发于骨的恶性肿瘤,易发生早期肺转移且预后差,恶性程度高.本研究小组前期研究发现,IEX-1在骨肉瘤中具有重要作用.为了阐明其作用机制,本研究运用酵母双杂交技术筛选其相互作用蛋白,共鉴定出12个IEX-1相互作用蛋白,包括生物氧化相关酶类、分子伴侣、信号转导相关蛋白等.并首次证实clusterin(CLU,又名载脂蛋白J)与IEX-1存在相互作用,两者在细胞中具有很好的共定位.采用RNAi干扰减低骨肉瘤细胞中内源性CLU表达水平,显著抑制了细胞增殖与细胞侵袭能力.为阐明IEX-1在骨肉瘤发生发展中的作用机制提供了重要的线索,为骨肉瘤的早期诊治及预后监测提供了新的靶点.     

应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白

前S1蛋白（PreS1）在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用．为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GST）融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离. 结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75)．通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用．实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究．