家蝇抗真菌肽衍生物MAF-1C抗白色念珠菌活性研究

[目的]探究家蝇抗真菌肽衍生物MAF-1C结构特点及抗白色念珠菌活性。[方法]采用氨基酸替代法设计MAF-1A衍生肽MAF-1C,生物信息学分析其理化特性,微量液体稀释法、菌落计数法检测体外抗白色念珠菌活性,扫描电镜观察对菌细胞结构的影响。[结果]MAF-1C为非跨膜阳离子线状多肽,带8个正电荷,二级结构以α螺旋为主。对白色念珠菌具有抗菌活性,MIC、MFC值分别为0.2 mg/m L和0.5 mg/m L,2×MIC浓度的MAF-1C从作用一开始就发挥抗菌作用,其作用后白色念珠菌细胞表面出现明显的凹陷、裂痕,之后细胞皱缩、裂解死亡,并且菌细胞损伤程度与肽浓度及作用时间呈正相关。[结论]MAF-1C结构参数及对白色念珠菌的抗菌活性均显著优于模板肽,对比模板肽改造后的肽阳离子电荷增加了6个,总平均疏水值(GRAVY)由-1.081升高到0.588,不稳定系数由42.27降低到5.83,MIC由0.6 mg/m L降低到0.2 mg/m L,MFC由0.7 mg/m L降低到0.5 mg/m L,其可通过破坏白色念珠菌细胞结构发挥抗菌作用。     

杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性测定

为获得溶血活性低、抗菌活性高的杂合抗菌肽,以家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin为母体肽,并结合毕赤酵母偏爱密码子的原则,设计出6条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽,将其命名为CC22、CC28、CC29、CC30和CC34(1),CC34,利用SOE-PCR技术合成所需的目的基因,并将其克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA,通过电击转化技术,将其转化至毕赤酵母SMD1168中,经含有Zeocin的抗性平板筛选阳性转化子,YPD液体培养72h后,经Tricine-SDS-PAGE检测出目的蛋白,然后采用高效液相色谱法对其进行纯化。检测结果显示,表达产物CC29对大肠杆菌、鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)均为25μg/ml;CC34(1)对大肠杆菌表现相对较弱的抑制作用,最小抑菌浓度为100μg/ml;CC34对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为50μg/ml;且杂合抗菌肽对有益菌均没有表现出抑制作用。6条杂合肽的溶血活性均呈现较低水平,其中表现出抗菌活性的3条抗菌肽中,以CC29的溶血活性最低,CC34(1)和CC34相对次之。结合抑菌活性,CC29和CC34的抑菌效果较为明显,从而确定溶血活性低且抗菌活性较高的CC29和CC34为新型杂合抗菌肽。     

三条新颖短肽筛选及抑菌作用的初报

[目的]为了发现新的农作物病原菌抗菌肽,人工设计并构建了大容量短肽文库,从中筛选并合成96条短肽用于鉴定其对农作物病原菌的抑菌活性.[方法]采用琼脂扩散法,对靶标菌一棉花枯萎病菌(Fusarium f.sp.vasinfecum)、棉花红腐病菌(Fusarium moniliforme)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)和马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)进行抑菌初筛,并测定了有抗菌作用短肽的最小抑菌浓度和抑菌持久性.[结果]得到了A6、D4和F10对上述四种病原真菌抑菌效果较强,抑菌时间较长的抗菌肽,通过与抗菌肽数据库氨基酸序列对比,未见这3条抗菌肽的同源序列.[结论]研制的3条短肽属于新颖抗菌肽,为防治农作物真菌病害提供了新的基因资源.     

利用亮氨酸和赖氨酸设计新型α-螺旋抗菌肽

【目的】根据螺旋轮模型设计以亮氨酸(L)为疏水面,赖氨酸(K)为亲水面的新型α-螺旋抗菌肽LK,并对该抗菌肽的生物学活性进行检测。【方法】利用圆二色光谱分析LK的二级结构,同时,评价LK的抑菌活性、稳定性和细胞选择性。【结果】在模拟细胞膜的环境中LK呈α-螺旋型结构。LK对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有很强的抑菌活性,最小抑菌浓度(MIC)在2-4μmol/L之间。LK具有很强的酸碱盐稳定性。肽浓度为2-4μmol/L时,LK表现出较低的溶血活性和细胞毒性。【结论】根据螺旋轮模型结构,以疏水性的L和正电荷性的K设计的新型抗菌肽LK具有较高的细胞选择性及稳定性,具有替代抗生素的发展潜力。     

来自穿膜肽的新肽的抗菌活性及抑菌机制

[目的]研究基于穿膜肽和抗菌肽构效关系改造获得的新肽P7的抗菌活性及其对大肠杆菌(E.coli)的抑菌机制.[方法]微量稀释法和溶血实验分析P7的抑菌活性及其对正常细胞的细胞毒性;采用膜荧光探针、流式细胞术和扫描电镜分析P7对E.coli膜通透性、膜完整性的影响和细胞超微结构变化;通过激光共聚焦分析P7在E.coli细胞中的定位;凝胶阻滞实验测定P7与E.coli基因组DNA结合能力.[结果]P7比母肽显示更强的抑菌活性,最低抑菌浓度范围为4-32 μmol/L,且在作用浓度范围内具有较弱的溶血活性.P7可以增加E.coli外膜和内膜的通透性,使E.coli细胞膜的完整性和细胞表面结构受损.同时P7可以穿过E.coli细胞膜在细胞质聚集并与基因组DNA结合.[结论]P7通过增加E.coli内外膜通透性,穿过细胞膜与胞内DNA结合发挥抑菌活性.     

5-氯水杨醛缩2,4-二羟基苯酰肼的抗菌抗氧化活性研究

目的考察5-氯水杨醛缩2,4-二羟基苯酰肼对金黄色葡萄球菌的抗菌活性及体外抗氧化活性。方法采用试管法和平板法测定其对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC),绘制杀菌曲线,并通过扫描电镜研究其作用机制,采用DPPH法测定抗氧化活性。结果该化合物对金黄色葡萄球菌的MIC为2.5 mg/m L,MBC为5 mg/m L。杀菌曲线结果表明该化合物对金黄色葡萄球菌的杀菌作用表现出明显的浓度依赖性。扫描电镜结果表明该化合物的作用机制可能与破坏菌体细胞壁、改变其通透性有关。同时该化合物具有较强的清除自由基的能力。结论 5-氯水杨醛缩2,4-二羟基苯酰肼具有显著的抗金黄色葡萄球菌作用,同时具有较好的体外抗氧化活性。     

枯草芽孢杆菌HS-A38高产抗菌肽突变株的筛选及其抑菌机理的研究

本研究通过采用多种诱变方法以提高枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌肽能力,并研究诱变株产抗菌肽活性物质对副溶血弧菌的抑制作用机理。原始菌株经过多种复合诱变后,最终获得一株抗菌活性明显提高的诱变菌株(mut HS-301)。进一步研究采用双倍稀释法确定最低抑菌浓度,并通过扫描电镜观察、胞膜通透性和胞膜完整性的测定,初步阐述该抗菌肽的抑菌机理。结果表明:诱变菌株mut HS-301对副溶血弧菌的抑菌活性较原始菌株提高了20%;抗菌肽成品对副溶血弧菌的最低抑菌浓度为0.625 mg/m L;抗菌肽破坏了菌体细胞的形态,出现形变;随着抗菌肽作用时间的增加,胞外紫外吸收物质和胞外蛋白含量明显增加,说明抗菌肽影响了副溶血弧菌细胞膜的通透性,其胞膜的完整性遭到破坏,影响其代谢活性,从而抑制副溶血弧菌的生长。该研究表明,微生物产抗菌肽主要作用于细菌细胞膜,该产品适宜添加到水产动物养殖饲料中,对提高水产动物免疫力和预防疾病起重要作用。     

抗菌肽活性及天然抗菌肽的改造

抗菌肽具有抗菌谱广、热稳定性强、分子量小及免疫原性小等特点,其杀菌机制独特,病原菌不易产生耐药性,有望开发成新一代肽类抗生素。本文主要综述了影响抗菌肽生物活性的生化性质,即螺旋度、疏水性、两亲性、正电荷数等,并从结构的角度论述了其对抗菌肽抑菌活性的影响。部分抗菌肽具有空间结构不稳定、溶血活性等缺点,限制了其临床应用。因此,对天然抗菌肽的改造也成为目前抗菌肽的研究热点,本文还综述了天然抗菌肽的改造方法。     

β-发卡抗菌肽的全新设计及其生物学活性

通过缬氨酸和精氨酸的交替连接形成β-发卡结构的两条侧链,D-脯氨酸和甘氨酸形成β-转角单元以及侧链末端的两个半胱氨酸连接形成一个二硫键,来设计得到全新的由16残基构成的β-发卡抗菌肽VR。对设计得到的抗菌肽VR的生物学活性进行了检测,主要测定了新型β-发卡抗菌肽VR的最小杀菌浓度、对红细胞的溶血活性、杀菌动力学和盐敏感性。结果发现,VR和蜂毒素具有相似的杀菌活性,而溶血活性远低于蜂毒素,这表明VR比蜂毒素具有更高的细胞选择性。在NaCl的浓度低于100 mmol/L时,VR的杀菌活性没有受到影响;在NaCl的浓度为100 mmol/L时,VR具有50%的杀菌活性。综上可见,VR具有较优异的生物学活性,拥有成为抗生素替代物的发展潜力。     

抗菌肽Lfcin15-Me8分子设计及对老年呼吸道致病菌铜绿假单胞菌的抑菌性能分析

探讨人工设计合成的Lfcin15-Me8分子对老年病患者中铜绿假单胞菌抑菌活性研究。从老年病患痰液中分离鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染情况,截取牛乳铁蛋白素(Lfcin B)1-15和蜂毒素(Melittin)1-8核心氨基酸序列,固相合成新型抗菌肽分子,采用微量肉汤稀释法,测定新型抗菌肽分子对临床分离菌株的抑菌活性。结果显示,铜绿假单胞菌占院内感染的32.2%,位列致病菌第二位。合成的新型抗菌肽分子Lfcin15-Me8,为阳离子型抗菌肽,并富含α-螺旋。对临床铜绿假单胞菌抑菌MIC值均达到128μg/m L以下,其中最低达到32μg/m L,具有良好抗菌活性。铜绿假单胞菌在老年呼吸道感染中占较大比重,需注意防控,人工合成的Lfcin15-Me8分子可抑制临床铜绿假单胞菌的生长繁殖。     

贝莱斯芽孢杆菌Y6抗菌肽抑制白念珠菌活性的研究CSCD

目的对贝莱斯芽孢杆菌Y6代谢物抑制白念珠菌活性及其作用机理进行初步研究。方法采用平板结合牛津杯研究贝莱斯芽孢杆菌Y6发酵上清液对白念珠菌抑制活性,梯度稀释法测定了最小抑菌浓度(MIC),通过薄层色谱法对代谢物的活性成分进行筛检;同时比较抗菌肽处理前和处理后菌体胞内大分子释放量及荧光染料PI的摄入量的变化,考察抗菌肽对胞膜通透性影响。结果贝莱斯芽孢杆菌Y6代谢物能有效抑制白念珠菌生长繁殖,测试浓度为10 mg·mL^(-1)时,抑菌圈直径达到(38.2±0.5)mm,其MIC浓度为0.625 mg·mL^(-1);通过薄层色谱结合茚三酮显色对活性组分筛检发现Y6代谢物中有2个抗菌组分,其中主要活性组分遇茚三酮显紫色,推测为肽类组分;经抗菌肽处理后的白念珠菌胞内大分子释放量及PI摄入量明显高于对照组,表明菌株Y6抗菌肽对白念珠菌胞膜完整性具有一定的损伤作用。结论贝莱斯芽孢杆菌Y6产肽类抗菌物质,且对白念珠菌细胞膜存在一定的损伤作用,从而产生明显的抗菌活性。     

类芽孢杆菌BD3526抑菌活性物质的初步分离及性质测定北大核心CSCD

本实验以一株类芽孢杆菌BD3526为研究对象,采用丙酮浸提菌体得到抑菌活性粗品,通过Sephadex LH-20对样品进行初步纯化,结果表明粗品对藤黄微球菌CGMCC1.1848的最低抑菌浓度(MIC)为12.5 mg/m L,对金黄色葡萄球菌CGMCC1.879和单增李斯特菌CGMCC1.9136的MIC为25 mg/m L;Sephadex LH-20纯化样品对藤黄微球CGMCC1.1848的MIC为1 mg/m L,对金黄色葡萄球菌CGMCC1.879和单增李斯特菌CGMCC1.9136的MIC为2 mg/m L。样品经链霉蛋白酶处理后,活性基本消失。经加热、酸碱、胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶K处理后,活性没有明显变化。因此,类芽孢杆菌BD3526产生的是一种细菌素类的抑菌物质,该抑菌物质在食品和医疗行业有广阔的应用前景。     

类芽孢杆菌BD3526抑菌活性物质的初步分离及性质测定

本实验以一株类芽孢杆菌BD3526为研究对象,采用丙酮浸提菌体得到抑菌活性粗品,通过Sephadex LH-20对样品进行初步纯化,结果表明粗品对藤黄微球菌CGMCC1.1848的最低抑菌浓度(MIC)为12.5 mg/m L,对金黄色葡萄球菌CGMCC1.879和单增李斯特菌CGMCC1.9136的MIC为25 mg/m L;Sephadex LH-20纯化样品对藤黄微球CGMCC1.1848的MIC为1 mg/m L,对金黄色葡萄球菌CGMCC1.879和单增李斯特菌CGMCC1.9136的MIC为2 mg/m L。样品经链霉蛋白酶处理后,活性基本消失。经加热、酸碱、胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶K处理后,活性没有明显变化。因此,类芽孢杆菌BD3526产生的是一种细菌素类的抑菌物质,该抑菌物质在食品和医疗行业有广阔的应用前景。     

恩诺沙星对4种水产致病弧菌的抑杀菌效应

采用二倍稀释法测定恩诺沙星对溶藻弧菌、最小弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌4种12株菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),结果表明:恩诺沙星对12株弧菌的MIC为0.1?0.8 mg/L,MBC为0.4?3.2 mg/L。在此基础上,从每种菌中选取一株对恩诺沙星较为敏感的菌株,研究恩诺沙星不同药物浓度(1 MIC、2 MIC、4 MIC)对4种弧菌的杀菌动力学和抗菌后效应(PAE),结果显示:各浓度恩诺沙星对溶藻弧菌X040625-R菌株均有较强的杀菌作用,而对哈维氏弧菌M071202-H、创伤弧菌Q050723-C、最小弧菌H010911-Z等3菌株却表现出了低浓度抑菌、高浓度缓慢杀菌的作用。恩诺沙星的抗菌后效应PAE与药物浓度及细菌与药物的接触时间成正相关,恩诺沙星对溶藻弧菌X040625-R的PAE最长,对哈维氏弧菌M071202-H的PAE最短。     

23种中草药的体外抗菌活性筛选研究

为考察中草药抗菌物质基础筛选出活性提取物,该研究通过80%乙醇冷浸和95%乙醇回流提取制备23种中草药的提取物,采用琼脂扩散法测量抑菌圈直径,用微量液体培养基倍比稀释法测定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal/fungicidal concentration,MBC/MFC),并测定了提取物对临床4种常见病原菌体外抗菌活性。结果表明:紫珠草、千斤拔、黄龙尾等9种中草药对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性,其MIC/MBC值除个别菌是12.5 mg·mL~(-1)外,其他都在0.09～3.12 mg·mL~(-1)之间;千斤拔、大红袍、过江龙等5种中草药对铜绿假单胞菌有较强抑菌活性,其MIC/MBC值在3.12～12.5 mg·mL~(-1)之间;紫珠草、千里光、石楠等13种中草药对大肠埃希菌有较强的抑菌活性,其MIC/MBC值在0.09～6.25 mg·mL~(-1)之间;八角对白色念珠菌有较强抑菌活性,其MIC/MFC值在0.78～12.5 mg·mL~(-1)之间。23种中草药的抗细菌活性较好,尤其是千斤拔、大红袍、过江龙、八角、黄药子对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌都具有较好的抑菌活性,具有广谱抗菌活性;但对真菌抑菌效果不明显,仅有八角对白色念珠菌有抑菌活性。此外,提取溶剂浓度、提取温度和提取时间对中草药的提取率和活性均有影响,冷提稍优于热提。     

合成多肽对结核分枝杆菌的胞内抑制作用

评价合成多肽对人白血病单核巨噬细胞THP-1的毒性和对结核分枝杆菌H37Rv的胞内抑菌作用。通过多肽的不同给药浓度,确定多肽对结核分枝杆菌的最小抑菌浓度(MIC),利用流式细胞术方法和MTT法检测2号肽对细胞THP-1的毒性作用,同时采用CFU方法检测其对H37Rv菌株的胞内抑菌作用。筛选的4条多肽均有抑菌作用,其中2号肽的最小抑菌浓度(MIC)最小,为200μg/m L。2号肽与细胞THP-1作用时,浓度为1 200μg/m L时表现出细胞毒性,与INH细胞毒性无显著差别。对于胞内H37Rv,2号肽抗结核作用具有时间和剂量依赖效应,随给药时间和剂量的增加H37Rv菌落数明显下降。2号肽不仅对巨噬细胞THP-1的毒性小,而且具有较好的抗胞内结核分枝杆菌活性,是一种潜在的抗结核新型药物。     

条斑紫菜蛋白酶解产物中抗菌肽的纯化及特征

以酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑菌能力为指标,筛选出木瓜蛋白酶并优化确定酶解条件,酶解液中分子量在1000 Da以下的小分子肽类占96.68%;采用DEAE-52纤维素阴离子交换层析、Sephadex G-25凝胶层析得到纯化的紫菜蛋白抗菌肽(LPAP);液质联用分析该纯化抗菌肽中主要的多肽序列为FFDD(Phe-Phe-AspAsp);该LPAP对G+菌和G-菌都有抑制作用,具有相对广谱性,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)为0.25 mg/m L,抗菌肽作用金黄色葡萄球菌的电镜照片表明其抑菌机制可能是对细胞膜的破坏作用。     

黄芩素在化妆品中多功效研究及安全性评价

本文以黄芩素为研究对象,通过生化酶学法、自由基清除测试、最低抑菌浓度(MIC)测定及红细胞溶血实验等实验,对其进行美白、抗氧化、抗过敏、抑菌等功效研究及安全性评价。结果显示,浓度达到2.0 mg/m L的黄芩素,对酪氨酸酶的抑制率为60.20%;当浓度达到0.1 mg/m L和1.0 mg/m L时,其对DPPH·和·OH清除率分别为95.21%和66.69%;当浓度达到10.0 mg/m L时,对透明质酸酶的抑制率是52.51%;当浓度达到1.25 mg/m L时,其对5种菌均有抑制作用;其半数溶血率(HD_(50))为1.80 mg/m L,蛋白质变性指数(DI)为0.34,HD_(50)/DI(H/D)10。实验表明,黄芩素具有较好的美白、抗氧化、抗过敏、抑菌功效且具有安全性。     

蓝青抗病毒合剂对临床分离细菌体外抗菌、抗病毒作用研究

为了探讨蓝青抗病毒合剂的体外抗菌和抗病毒作用,本研究采用连续倍比稀释法进行药物体外抑菌实验,测定几种常见细菌的最低杀菌浓度(MBC)和最低抑制浓度(MIC);采用MTT法,进行体外抗病毒实验,测定蓝青抗病毒合剂对病毒半数中毒浓度TC_(50)、半数有效浓度EC_(50)及最低有效抑菌浓度。结果表明,蓝青抗病毒合剂对实验室保存菌种金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、大肠埃希菌的MIC分别为15.56 mg/m L、7.78 mg/m L、31.13 mg/m L;MBC分别为15.56 mg/m L、15.56 mg/m L、62.25 mg/m L。蓝青抗病毒合剂对Hela细胞的半数中毒浓度(TC_(50))为12.21 mg/m L;对MDCK细胞半数中毒浓度(TC_(50))6.25 mg/m L;对呼吸道合胞病毒的半数抑菌浓度(EC_(50))为3.74 mg/m L,在2.56 mg/m L以上的浓度时对流感病毒引起的细胞病变及血凝现象有明显抑制作用。从这里我们可以看出,蓝青抗病毒合剂具有一定的抗菌、抗病毒作用。     

家蝇幼虫分泌物抗菌肽的生化特性初步研究

研究了不同温度、蛋白酶及反复冻溶对家蝇 Musca domestica 幼虫活体浸泡法获得的分泌物抗菌肽抗菌活性的影响;并检测其凝血效应;试管稀释法测定其最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）;SDS-PAGE分析其分子量范围。结果表明,该抗菌肽具有较强的热稳定性、酶稳定性及较强抗菌活性的特性,无凝血作用。对大肠埃希菌的最低抑菌浓度为37 μg/mL、最低杀菌浓度为75 μg/mL;分子量约10 kD。