蚕豆萎蔫病毒2号山西分离株的全基因组序列测定与分析

本试验在生物学接种的基础上,利用非序列依赖性PCR扩增（sequence-independent amplification,SIA）对感病青椒（Capsicum annuum）进行了分子鉴定. 序列测定及分析发现,侵染青椒的病毒为蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2, BBWV2）. 为明确BBWV2青椒分离物（BBWV2 Ca）的分类地位,对BBWV2 Ca的全基因组序列进行了分段克隆、序列测定和分析. BBWV2-Ca RNA1全长5 929 bp,含有1个ORF. BBWV2 Ca RNA2全长3 559 bp,含有1个ORF,编码3种蛋白：VP53/VP37、外壳蛋白大亚基（large coat protein, LCP）和外壳蛋白小亚基(small coat protein, SCP). 全序列核苷酸同源性分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在77.9%～93.7%之间|RNA2与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在80.2%～93.8%之间. 全序列系统进化分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2-XJ14-3以及BBWV2-RP3株系聚为一簇,亲缘关系最近|RNA2与BBWV2-Am形成一个独立分支,亲缘关系最近.     

蚕豆萎蔫病毒2中国分离物全基因组结构及可能的基因表达方式

报道了蚕豆萎蔫病毒2的B935分离物全基因组序列。RNA1和RNA2分别由5956和3601个核苷酸组成[不包括3‘端未知长度的poly（A）尾巴]。RNA1和RNA2均包含单个阅读框,分别编码分子量为210063（210kD）和119002（119kD）的蛋白质。对外壳蛋白N端氨基酸序列测定表明,外壳蛋白大、小亚基（LCP、SCP）为119kD蛋白质在466／467位的Q／C和868／869位的Q／A位点切割形成的中间和C端蛋白,而端蛋白与豇豆花叶病毒58kD/48kD移动蛋白具有一定的同源性,并且包含一个类似病毒移动蛋白特有的rNTP结合域,推断为移动蛋白。通过与豇豆花叶病毒科病毒RNA1编码的多聚蛋白的同源性比较及功能蛋白保守序列的查找,表明210kd蛋白质可切割形成RdRp、蛋白酶、包含NTP结合域蛋白（NTBM）、蛋白酶辅助因子和Vpg等成熟蛋白,并进一步对其切割位 作了分析,根据LCP和SCP氨基酸序列所作的系统关系树充分证明了蚕豆萎蔫病毒（BBWV）两个血清型,确应命名为两个不同的病毒。     

侵染白术的蚕豆萎蔫病毒2号的分子检测与序列分析

为鉴定引起山西绛县白术花叶、黄化等症状的病原,利用生物学接种、非序列依赖性PCR扩增(SIA)和RTPCR的研究方法,对白术病样进行了研究,结果表明:接种感病白术病汁液的指示植物昆诺藜表现退绿枯斑,经单斑分离后转接健康白术植株呈现出与病样类似的症状,初步证明白术病害可能为病毒引起的;SIA检测表明感病白术为蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)侵染所致;为明确BBWV2白术分离物(BBWV2-Am)的分类地位,进一步克隆了BBWV2-Am RNA2外壳蛋白大亚基基因(LCP)和外壳蛋白小亚基基因(SCP)序列;序列同源性分析表明,LCP基因和SCP基因与已发表的BBWV2其它株系相应基因核苷酸序列的同源性分别为79.3%~87.2%和80.1%~89.2%,氨基酸序列同源性分别为91.2%~95.7%和89.4%~95.5%;系统进化树分析显示,BBWV2-Am与BBWV2地黄分离物(BBWV2-Rg)形成一个独立分支,二者亲缘关系最近。这是BBWV2侵染白术的首次报道。     

蚕豆萎蔫病毒2号分离物侵染对蚕豆叶片光合活性和叶绿体超微结构的影响

研究了受蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV2）中国分离物B935和欧洲分离物PV131侵染的蚕豆（Vicica faba）叶片光合特性、叶绿素荧光诱导动力学参数和叶绿体超微结构变化。感病蚕豆叶绿素含量减少,叶绿素a／b比逐步降低;光合气体交换参数Pn值和Gs值降低,Ci值升高;叶绿素荧光诱导动力学参数Fv/Fm、FV＇/Fm＇、ΦPSII、qP值均有不同程度降低,NPQ值升高;光合器结构遭到不同程度的破坏,B935侵染后叶绿体发育不良,片层结构疏松,PVl31侵染后叶绿体肿胀变圆,片层结构疏松瓦解。与B935相比,PV131侵染对以上各参数的变化有更大影响,且对叶绿体的破坏更为严重。实验结果表明BBWV2不同分离物对光系统II（PSII）的抑制作用与光合器受损程度相关。     

蚕豆萎蔫病毒—新疆番茄分离株的鉴定

在新疆番茄斑驳病株上分离出一种球状病毒,回接到番茄上产生斑驳症状。病毒粒体为２０面体,平均直径２５ｎｍ。经汁液摩擦接种可感染昆诺阿藜、苋色藜、蚕豆、番茄等１８种植物,不感染菜豆、豇豆、豌豆、六叶茄、黄瓜等。可由桃蚜传毒。在琼脂双扩散试验中,能与蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）抗血清产生明显的沉淀线,与豇豆花叶病毒（ＣｐＭＶ）、黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）抗血清均不发生反应。纯化病毒紫外扫描呈典型的核蛋白吸收叫线,病毒衣壳蛋白由两种蛋白亚基构成,其分子量分别为４５９００和２０４００道尔顿,由１８种氨基酸约２５５个氨基酸残基组成。病毒核酸是双组份的,它们的分子量为１３２００００和２３４００００道尔顿。根据上述结果认为该病毒是蚕豆萎蔫病毒侵染番茄的一个株系。     

菊花R病毒杭白菊分离株全基因组序列测定与分析

杭白菊作为著名的中药“浙八味”之一,种植规模和产区不断扩大,但其病毒病的发生也日益严重,对其产量和品质造成严重影响。本研究利用双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）和非序列依赖PCR扩增（sequence independent amplification,SIA）等方法,对感病杭白菊病原物进行鉴定,为杭白菊病毒病原的检测构建一套快速和简便的方法。结果表明,感病杭白菊被菊花R病毒（Chrysanthemum virus R,CVR）侵染,将其命名为CVR-TX。通过对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其全长基因组为8 872 bp,编码6个ORF,具有Carlavirus属病毒的典型特征。基于全基因组核酸序列以及复制酶、外壳蛋白氨基酸的序列比对发现,CVR-TX与CVR-BJ同源性最高,分别为85.5%、96.0%和96.3%;与Carlavirus属其他病毒同源性分别在48.2%～54.4%、46.9%～55.3%和36.8%～59.5%,因此CVR被确定为一种新的Carlavirus属病毒。系统进化分析表明,基于全长基因组、复制酶（replicase）基因和外壳蛋白（coat protein,CP）基因与CVR-BJ聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了CVR-TX的全长基因组,丰富了CVR的基因组信息,通过生物信息学分析明确其种属关系和区域变化情况,从而为建立CVR可靠灵敏的分子检测手段和有效的防控措施提供理论基础。     

菊花R病毒杭白菊分离株全基因组序列测定与分析

杭白菊作为著名的中药“浙八味”之一,种植规模和产区不断扩大,但其病毒病的发生也日益严重,对其产量和品质造成严重影响。本研究利用双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）和非序列依赖PCR扩增（sequence independent amplification,SIA）等方法,对感病杭白菊病原物进行鉴定,为杭白菊病毒病原的检测构建一套快速和简便的方法。结果表明,感病杭白菊被菊花R病毒（Chrysanthemum virus R,CVR）侵染,将其命名为CVR-TX。通过对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其全长基因组为8 872 bp,编码6个ORF,具有Carlavirus属病毒的典型特征。基于全基因组核酸序列以及复制酶、外壳蛋白氨基酸的序列比对发现,CVR-TX与CVR-BJ同源性最高,分别为85.5%、96.0%和96.3%;与Carlavirus属其他病毒同源性分别在48.2%～54.4%、46.9%～55.3%和36.8%～59.5%,因此CVR被确定为一种新的Carlavirus属病毒。系统进化分析表明,基于全长基因组、复制酶（replicase）基因和外壳蛋白（coat protein,CP）基因与CVR-BJ聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了CVR-TX的全长基因组,丰富了CVR的基因组信息,通过生物信息学分析明确其种属关系和区域变化情况,从而为建立CVR可靠灵敏的分子检测手段和有效的防控措施提供理论基础。     

蚕豆萎蔫病毒纯化和病毒蛋白质及RNA组份分析

属蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）血清ＩＩ型的分离物Ｂ－９３４接种昆诺藜,采收的病叶先用含蔗糖的高浓度磷酸钾盐缓冲液,后用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００处理,成功地提取了大量病毒粒子,提纯病毒得率为１３４ｍｇ／ｋｇ病叶,提纯病毒在电镜下可观察到大量球状病毒粒子,直径约２５ｎｍ,提纯的ＢＢＷＶ经甘油梯度超离心后在可观察到３个组份,分别称Ｔ,Ｂ和Ｍ组份,其中Ｔ为空壳蛋白,Ｂ和Ｍ为核蛋白,各组份经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定,     

蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体制备及检测应用

:用蚕豆萎蔫病毒(BBWV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得6株能稳定传代并分泌抗BBWV单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞株,单抗腹水ELISA滴度为1:320000～1:640000,各单抗抗体类型均为IgG1。6株单抗与BBWV不同分离物均有反应,而与其它植物病毒无交叉反应。经Westernblot印迹分析表明,此6株单克隆抗体均是针对BBWV447kD的外壳蛋白大亚基的特异性抗体。这是国内外首次报道获得BBWV单克隆抗体     

22株猪圆环病毒2型安徽分离株全基因组遗传进化分析

为了解安徽地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学及流行毒株遗传变异情况,本研究应用DNA Star软件,针对22株PCV2安徽分离株和26株GenBank登录的PCV2参考毒株,进行全基因组核苷酸序列、ORF1和ORF2核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性分析,并运用MEGA 6.0软件构建系统进化树.结果显示,22株PCV2安徽分离株基因组全长均为1 767 bp,相互之间的核苷酸序列相似度为94.6％～99.8％,与GenBank登录的26株PCV2参考毒株之间的核苷酸序列相似度为92.4％～99.8％.PCV2安徽分离株的ORF1核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与参考毒株之间的相似度分别为94.3％～100％和85.4％～100％,ORF2核苷酸序列及其推导的氨基酸序列相似度分别为85.9％～99.9％和76.9％～100％.ORF2编码的Cap蛋白氨基酸序列在8～30、44～91、121～140及190～224几个区域存在突变,且有部分变异位点位于抗原表位区.22株PCV2安徽分离株分布于两个基因亚型,8株属于PCV2b,14株属于PCV2d.结果表明,PCV2安徽分离株的全基因组核苷酸序列较稳定且彼此间亲缘关系密切.ORF2的变异程度远高于ORF1,PCV2d基因亚型己经逐渐过渡成为安徽地区的主要流行毒株.Cap蛋白氨基酸序列在免疫反应区域内的变异可能影响PCV2的免疫原性.本研究结果丰富了安徽地区猪圆环病毒病的分子流行病学资料,同时也为有效防控该病提供了一定的参考依据.     

Transmissibility of Broad bean wilt virus 1 by aphids: influence of virus accumulation in plants,virus genotype and aphid species

Broad bean wilt virus 1 (BBWV‐1) is transmitted by several aphid species in a non‐persistent manner. Transmission efficiency by vectors is a key factor for understanding virus epidemiology and applying disease control measures based on limiting virus spread. We evaluated the transmission rates of two genetically divergent BBWV‐1 isolates (PV‐132 from USA and Ben from Spain) infecting broad bean (Vicia faba L.) by isofemale lines of nine aphid species from eight different genera collected in Spain. Our analyses showed that: (a) the virus concentration in the source plant was a key factor in BBWV‐1 transmissibility; (b) The Spanish isolate Ben was transmitted more efficiently than the American isolate PV‐132 by most aphid species, but this was only due to the higher accumulation of Ben in plants, as both isolates had similar transmissibility after adjusting virus concentration and (c) The transmission rate varied greatly between the different aphid species.     

我国两株登革2型病毒基因组的全序列分析

本研究对我国两株登革２型病毒Ｄ２－４３株、Ｄ２－０４株的基因组进　行　了全序列测定,在此基础上对这两株引起不同临床症状及鼠神经毒力的登革病毒的基因组序　列进行了比较分析,结果表明Ｄ２－４３株与Ｄ２－０４株基因组全长约为１０　７２３ｎｔ,核苷酸序列的同源性为９５．１％,氨基酸序列的同源性为９７．６％,　不存在特别的高变区。这两株序列中共有８３个核苷酸的变化导致了氨基酸的变化,其中２１个　差异氨基酸可引起所在位点电荷或极性的变化,位于登革病毒粒子表面的Ｅ糖蛋白第１２６位氨　基酸由Ｇｌｕ　（Ｄ２－０４株）→Ｌｙｓ（Ｄ２－４３株）的变化对其抗原性有影响,可能引起了病毒对鼠神　经　毒力的改变。对结构糖蛋白Ｅ基因的聚类分析表明Ｄ２－４３株与新几内亚株、台湾８７株及菲律　宾　８３株亲缘关系较近,Ｄ２－０４株与牙买加株及巴西９０年分离株的亲缘关系较近,表明我国存　在不同起源的登革２型病毒感染。     

Genomic Sequence Analysis of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus Isolated from Yunnan Sericulture Region,China

The blood pathogens of grasserie caused by Bombyx mori nucleopolyhedrovirus BmNPV have a serious impact on the sericulture industry. To understand the genetic status of BmNPV endemic strains in the Yunnan sericulture region, the structure and complete genome sequence of BmNPV isolated from Baoshan city of Yunnan Province were described and compared to known strains. The BmNPV-Baoshan isolate was a nucleopolyhedrovirus parasitized in silkworm larvae. Its genome has 128, 452 bp with a G + C content of 40.4%. Phylogenetic analysis clustered the virus with China BmNPV isolates; BmNPV-Baoshan was closely related to BomaNPV-S1 (both strains originated from the same ancestor). BmNPV-Baoshan strain has bro-b gene deletion, hr1 missing 4 repeat units of 30-bp palindrome structure compared to BmNPV-T3 strain. The aim of this study was to elucidate the evolution of the virus further and provide insights for the protection of virus-induced hematologic sepsis.     

我国登革 4型病毒 B5株基因组全序列的测定及分析(英文)

 对我国登革 4型病毒 B5株 (D4- B5)基因组进行全序列测定及分析 ,为研究病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革疫苗奠定基础 .根据登革 4型病毒 81 4669株的序列设计特异引物 ,通过 RT- PCR扩增出 D4- B5株不同长度的片段 ,分别克隆到 p GEM- T载体 ,将挑取的阳性克隆进行 PCR、酶切鉴定及序列测定 .结果显示 ,D4- B5株的基因组全长 1 0 665nt,5′和 3′非编码区分别为 1 0 1 nt和 40 3nt,中间一个长 1 0 1 61 nt的开放读码框架 ,编码 3387个氨基酸 .与 D4- 81 4669株比较 ,两者核苷酸序列同源性为 93.0 8% ,氨基酸序列同源性为 96.58% .D4- B5株的基因组全序列与 D4- 81 4669株类似 ,但也有较大差异 .同源进化分析表明 ,D4- B5株的基因型为 型 ,与登革 4型病毒菲律宾分离株亲缘关系较近 .这是首次报道的我国登革 4型病毒分离株基因组全序列 ,对研究病毒基因组结构与功能的关系 ,探讨我国毒株的地理来源及研制适合我国人群的新型登革疫苗具有一定的意义 .     

雌激素受体2（ESR2）mRNA 5′非翻译区内部核糖体进入位点活性的鉴定与分析

真核生物除了传统的帽依赖型翻译机制外,还存在内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）介导的翻译机制。雌激素受体2（estrogen receptor 2, ESR2）是雌激素受体家族成员之一,其编码的蛋白质在许多肿瘤中发挥重要的作用。ESR2蛋白的异常表达会导致众多肿瘤的发生,但其蛋白质翻译水平的调控机制至今仍不清楚。研究发现,在药物刺激的条件下,乳腺癌细胞MCF7/WT中ESR2蛋白的表达提高,但是其转录水平基本未见发生改变。猜测ESR2 mRNA 5′非翻译区（5′ untranslated region, 5′ UTR）具有IRES活性。为了验证ESR2 mRNA 5′ UTR是否具有IRES元件,将ESR2 mRNA 5′ UTR插入到双顺反子报告基因载体（pRF）中,构建pRL-ESR2-FL重组质粒载体,将其瞬时转染到HEK293细胞。结果发现,ESR2 mRNA 5′ UTR有假定的IRES活性。并且通过3个排除实验验证了ESR2 IRES活性与其5′ UTR中的内部潜在启动子（P<0.0001）、内部剪切位点以及核糖体通读无关。进一步对其序列进行截短研究发现,ESR2 IRES活性发挥的关键区域是3′端的439～468 nt,且ESR2 IRES最大活性的发挥依赖于5′ UTR序列的完整性。并且发现,ESR2 IRES活性的发挥不但需要特定的一级核酸序列,还要有稳定的二级茎环结构。此研究有望为ESR2蛋白调控的相关疾病提供新的药物治疗靶点。