内质网应激信号通路在肝纤维化中的研究进展

肝纤维化是各种因素导致的胶原大量沉积和炎症过度反应的病理过程,严重威胁人类的健康。寻求有效的肝纤维化治疗策略是全球性的医学难题。内质网损伤导致内质网应激,激活未折叠蛋白应答,介导三种跨膜蛋白(PERK、IRE1、ATF6)途径来维持内质网稳态,恢复内质网功能,而长期或过强的应激状态将诱导细胞相关凋亡信号表达和自噬,促进细胞死亡。目前研究发现内质网应激在肝纤维化的发生发展和逆转中起着重要作用。本文就内质网应激信号通路在肝纤维化中的作用进行综述。     

IRE1α在代谢性疾病中的作用

IRE1α介导的信号通路是未折叠蛋白反应中最为保守的通路,与动脉粥样硬化、肝功能疾病、肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发生发展过程密切相关。本文就IRE1α在上述疾病发生发展中的作用机制简单综述,进一步探究了IRE1α与代谢性疾病的相互作用机制的重要性,为疾病预防和临床治疗提供新的途径。     

靶向IRE1/XBP1信号通路的细胞水平高通量筛选模型建立

目的:建立基于细胞水平的inositol-requiring 1/X-box-binding protein 1 (IRE1/XBP1)信号通路高通量筛选模型,用于发现新型IRE1/XBP1信号通路抑制剂。方法:构建pCAX-F-XBP1△DBD-luciferase质粒,并与pcDNA3.1质粒共转人胚肾细胞HEK293,G418抗性筛选获得多个稳定表达荧光素酶的单克隆。结果:首先利用内质网应激诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)考察单克隆对内质网应激反应的敏感性,确定6#单克隆用于后续研究;其次对细胞接种量、溶剂DMSO终浓度和TM的作用浓度与孵育时间等条件进行优化,最终确定高通量筛选模型条件, Z'因子达到0.62;最后对包含多个激酶抑制剂在内的449个化合物进行筛选,发现27个潜在的IRE1/XBP1抑制剂,其中MG132、Sunitinib和Staurosporine的IC50分别为6.61(±1.51)μmol/L、6.25(±0.36)μmol/L和48(±8)nmol/L。结论:成功建立有效靶向IRE1/XBP1信号通路的高通量药物筛选模型,为基于IRE1/XBP1信号通路为靶点的药物发现奠定坚实基础。     

IRE1/TRAF2诱导细胞凋亡的分子机制

在细胞内质网应激中,IRE1/TRAF2/ASK1复合物可激活JNK信号通路,诱导细胞凋亡。IRE1-Lys828可被E3连接酶CHIP泛素化而激活。而TRAF2本身也具有RING结构域的E3泛素连接酶活性,可结合于IRE1的泛素化位点Lys828,促进IRE1磷酸化活化。IRE1/TRAF2复合物可募集ASK1,进而磷酸化激活JNK信号通路。另外,IRE1/TRAF2也可激活MAPK/p38、NF-κB以及caspase-12等信号途径,促进细胞凋亡。ASK1也是内质网应激IRE1/TRAF2诱导激活细胞凋亡所必需的。因此,TRAF2在调控细胞内质网应激,激活IRE1途径,诱导细胞凋亡中具有重要的作用,可作为一个靶点进行药物开发。     

细胞内质网应激与糖脂代谢紊乱的机制关联

在真核细胞中,内质网是蛋白质合成、折叠、加工及其质量监控的重要场所。当内质网难以承担蛋白折叠的高负荷时则引发内质网应激(ER stress),激活细胞的未折叠蛋白响应(unfoldedprotein response,UPR)。细胞通过内质网跨膜蛋白ATF6、PERK和IRE1介导的三条极为关键的UPR信号通路,调控下游相关基因的表达,以增强内质网对蛋白折叠的处理能力。因此,UPR通路在细胞的稳态平衡中具有举足轻重的作用,而这一动态过程的调控对于维持机体的正常生理功能至关重要。近来大量研究表明,在哺乳动物中内质网应激与机体的营养感应和糖脂代谢的调控过程密切相关。在肝脏、脂肪、胰岛以及下丘脑等不同的组织器官中,内质网应激均影响代谢通路的调节机制,因此在糖脂代谢紊乱的发生发展中扮演重要的角色。综上所述,进一步深入了解内质网应激引发代谢异常的生理学机制,可以为肥胖、脂肪肝及2型糖尿病等相关代谢性疾病的防治提供新的潜在药物靶点和重要的理论线索。     

布雷菲德菌素A调控IRE1-XBP1信号通路增强顺铂诱导GLC-82细胞凋亡的作用

长时间剧烈的内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）可启动ERS相关通路诱导细胞凋亡;而IREl-XBP1(肌醇需求蛋白1α-X盒结合蛋白1)为高度保守的ERS基本通路。它是最有前景的肿瘤治疗靶点之一。我们研究已证明,布雷菲德菌素A（brefeldin A,BFA）能增强顺铂（cis-dichlorodiamine platinum,CDDP）的肺癌细胞杀伤作用,但其分子机制尚不清楚。本研究证明了IRE1-XBP1通路在该协同效应中的作用。AnnexinV/PI双染结合流式细胞分析显示,与BFA或CDDP单独处理比较,BFA联合CDDP处理能增强人肺癌GLC-82细胞的凋亡。RT-qPCR和Western印迹揭示,与单独处理比较,BFA联合CDDP处理能增强GLC-82细胞的procaspase3转录本（mRNA）和蛋白质的表达,以及procaspase3的裂解激活,进一步证明了BFA联合CDDP处理可增强GLC-82细胞凋亡。最重要的是,RT-qPCR和Western印迹结果证明,与单独CDDP处理比较,BFA处理的GLC-82细胞中IRE1、XBP1水平明显上调（P < 0.05）,而BFA+CDDP处理的细胞中IRE1、XBP1水平进一步上调,超过BFA组（P < 0.01）。结果提示BFA和BFA+CDDP处理细胞可激活ERS的IRE1-XBP1通路。这些结果证明,BFA可通过激活ERS中的IRE1-XBP1通路增强顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡。本研究结果为IREl-XBP1是颇具前景的肿瘤治疗靶点提供了新的证据。     

内质网应激与脂类代谢

内质网应激激活的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)是维持机体代谢平衡的重要信号通路。同时,内质网与脂类合成、转运和分解密切相关。近来研究发现UPR对脂类代谢具有调节作用。主要讨论内质网应激激活的UPR对脂类合成、转运和分解的影响及其机制。     

RNF13通过IRE1/XBP-1 通路调控内质网应激介导的细胞凋亡

目的:在研究内质网应激介导的细胞凋亡过程中,我们发现Ring finger protein13(RNF13)具有促进细胞凋亡的功能。我们拟研究沉默RNF13后细胞对Tunicamycin等引起的细胞凋亡的影响,以及RNF13对活性形式的caspase3,XBP1(X-box binding protein 1)的剪切以及IRE1(Endoplasmic reticulum to nucleus signaling 1)磷酸化的影响以有助于了解RNF13促进细胞凋亡的信号通路的研究。方法:基因沉默RNF13,利用MTT方法研究RNF13沉默后对细胞增殖的影响,RNF13基因沉默后对XBP1剪切的影响,免疫印迹观察RNF13对IRE1磷酸化的影响。结果:RNF13基因沉默效率在80%以上。RNF13基因沉默后明显抑制细胞凋亡;敲低RNF13的细胞可抵抗衣霉素以及毒胡萝卜素的诱导的细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡的关键蛋白。敲低RNF13后caspase-3的活性形式明显降低(降低70%,P0.001)。在加入衣霉素引起内质网应激的情况下,敲除RNF13的细胞XBP1的切割活性明显降低。敲除RNF13的细胞中IREl的磷酸化明显降低(降低90%,P0.001)。结论:RNF13通过IRE1-XBP1信号通路调节细胞凋亡。     

未折叠蛋白响应的激活机制

未折叠蛋白在内质网（endoplasmic reticulum,ER）腔中累积造成ER应激，此时细胞启动未折叠蛋白响应（unfolded protein response,UPR）以恢复蛋白质稳态。目前已知有三种UPR感受器，即IRE1、PERK和ATF6，它们均为ER跨膜蛋白，在ER应激时被激活并启动下游UPR信号通路。虽然UPR感受器最早是在研究细胞如何应对ER应激时发现的，但它们如何感知ER应激至今未得到完满的回答。随着研究的深入，人们发现UPR的功能不仅限于维持蛋白质稳态，而UPR感受器也不是只对未折叠蛋白累积作出响应。本文对UPR的发现及其经典通路作一介绍，着重阐述目前已知的UPR感受器的激活机制，并就UPR和ER应激关系以及该领域存在的问题进行讨论。     

单宁酸联合顺铂增强肝癌HepG2细胞IRE1-XBP1通路的激活水平

本文主要研究单宁酸(TA)联合顺铂(CDDP)对肝癌HepG2细胞内质网应激IRE1-XBP1通路的影响。用180μM单宁酸、0.9μg/m L顺铂单独用药或者联合用药处理肝癌HepG2细胞24 h或48 h后,应用流式细胞技术测定HepG2细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR技术(q-RT-PCR)、蛋白免疫印迹(western blot)技术检测IRE1α和XBP-1分子的表达水平。MTT结果显示,单宁酸和顺铂均能显著抑制HepG2细胞的生长,且均呈剂量性依赖;二者联合用药能够显著增加HepG2细胞的生长抑制率;流式细胞术结果显示,单宁酸与顺铂联合用药能够显著抑制HepG2细胞的增殖,并诱导细胞凋亡的发生;q-RT-PCR及Western blot结果显示,单宁酸与顺铂联合用药能显著上调细胞IRE1α和XBP-1的表达水平。结果表明单宁酸能够联合顺铂增强肝癌HepG2细胞内质网应激IRE1-XBP1通路的激活水平,提示IRE1-XBP1通路可能是单宁酸和顺铂协同抗肝癌HepG2细胞的分子机制之一。     

Inositol-requiring protein 1 – X-box-binding protein 1 pathway promotes epithelial–mesenchymal transition via mediating snail expression in pulmonary fibrosis

Epithelial–mesenchymal transition (EMT) is a complex biological program during which cells loss epithelial phenotype and acquire mesenchymal features. EMT is thought to be involved in the pathogenesis of various fibrotic diseases including pulmonary fibrosis (PF). Recent studies suggest that endoplasmic reticulum (ER) stress is associated with EMT in the progression of PF. However, the exact mechanism is unclear. Here, we developed a PF model with bleomycin (BLM) administration in rats and conducted several simulation experiments in alveolar epithelial cell (AECs) RLE-6TN to unravel the role of inositol-requiring protein 1 (IRE1) – X-box-binding protein 1 (XBP1) signal pathway in ER stress-induced EMT in PF. First, we observed that ER stress was occurred in type II AECs accompanied by EMT in BLM-induced PF. Then we explored the role of IRE1-XBP1-snail pathway in transforming growth factor (TGF)-β1/tunicamycin (TM)-induced EMT. When TGF-β1/TM was treated on AECs, IRE1 and XBP1 were overexpressed, meanwhile, snail expression was upregulated accompanied with EMT. However, when IRE1 or XBP1 was knockdown, TGF-β1/TM-induced EMT were blocked while the expression of snail was inhibited. Then we silenced snail and found that TGF-β1/TM-induced EMT were also suppressed, but it had no effect on the up-regulated expression of IRE1 and XBP1. Thus, we concluded that IRE1-XBP1 pathway promotes EMT via mediating snail expression in PF.