一株枯草芽孢杆菌噬菌体的生物学特性分析及抗性菌株的诱变筛选

枯草芽孢杆菌工业生产发酵过程中经常出现噬菌体污染的问题,分离筛选以枯草芽孢杆菌为宿主菌的噬菌体,分析其生物学特性并采用自发突变方法筛选噬菌体抗性菌株。以枯草芽孢杆菌KC-260为宿主菌,从车间异常发酵液中分离纯化得到一株噬菌体,将其命名为P260,富集培养后测定效价,对其热稳定性、最佳感染复数、宿主范围、抑制剂和消毒剂耐受性等生物学特性进行了研究。为防治噬菌体P260的污染,利用自发突变的方法筛选对噬菌体P260有抗性的枯草芽孢杆菌突变菌。结果显示,分离纯化得到一株效价为3.45×1010 PFU/m L的噬菌体P260,该噬菌体具有一定的宿主专一性,对凝结芽孢杆菌和短小芽孢杆菌不敏感。噬菌体P260在高温条件下很容易失活,不耐热,70℃处理15 min存活率下降极为明显;25 mg/L的Cl O2对P260有极强的杀灭作用;0.5%的草酸铵和柠檬酸铵对该噬菌体有一定的抑制作用。P260感染宿主菌的最佳感染复数为0.01,增殖的潜伏期为15 min,45 min进入裂解期。通过自发突变的方法获得了抗噬菌体菌株ZF-260,发酵过程中添加噬菌体后ZF-260的生长不受影响,说明ZF-260是一株可以抗噬菌体P260的优良菌株。研究了噬菌体P260的生物学特性,获得了遗传稳定且活菌数高的抗性菌株ZF-260。     

芽孢杆菌BS-6基于全基因组数据的分类鉴定及拮抗能力分析

基于全基因组数据,确定芽孢杆菌BS-6的分类地位,验证其对植物病原菌的拮抗作用以及挖掘其潜在的生防功能。通过全基因组中16S rRNA及gyrA基因序列的系统发育分析及基因组分析方法确定芽孢杆菌BS-6的分类地位,通过平板对峙方法研究其对马铃薯枯萎病菌、玉米纹枯病菌和苹果轮纹病菌的拮抗能力;利用antiSMASH软件分析和预测菌株BS-6抑菌物质的相关基因并挖掘其生防潜力。基于16S rRNA及gyrA基因序列的系统发育分析及基因组分析结果,BS-6被鉴定为枯草芽孢杆菌,同时发现BS-6基因组中存在7种芽孢杆菌属重要或特有的次生代谢产物基因簇,4种未知功能的次生代谢产物基因簇,具有良好的抑制真菌生长的能力。枯草芽孢杆菌BS-6具有较强的拮抗植物病原菌的能力及良好的农业应用前景。     

地衣芽孢杆菌高产2,3-丁二醇菌株的选育和发酵研究

目前2,3-丁二醇生产菌株大部分为致病菌,对人类健康和环境具有一定威胁。从牛奶样品中分离到1株产2,3-丁二醇的芽孢杆菌127-7,分析其16S rRNA基因序列,确定该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。进一步对菌株127-7进行紫外诱变,筛选耐受高浓度葡萄糖和高产乙偶姻的菌株。摇瓶发酵结果显示,突变株BL41的2,3-丁二醇产量较出发菌株127-7提高了41.1%。对发酵副产物分析发现,不控制发酵液pH可以显著降低乳酸产量,2,3-丁二醇产量在72 h达到81.4 g/L。进一步调整补糖策略,维持最低残糖浓度为30 g/L,菌株BL41产2,3-丁二醇83.4 g/L,最高产率为1.9 g/L·h,发酵时间缩短至46 h。结果表明,地衣芽胞杆菌BL41可以作为候选菌株,用于工业规模2,3-丁二醇的生产。     

短小芽孢杆菌1037抗温和性噬菌体菌株的筛选及投产

由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)260/52诱筛的1037菌株,在500升罐上产碱性蛋白酶的能力稳定在8,000单位/毫升以上,生产能力较出发菌株提高40％以上。但该菌株在10吨罐上的产酶水平并不高于出发菌株。发酵中表现出二级种子种龄显著延长,发酵周期延长,产酶速率低,泡沫增多,菌体生长略有下降等异常现象。发酵液经平板检查出现噬菌斑,从而证明为噬菌体感染。于是,开展了短小芽孢杆菌抗噬菌体菌株的筛选工作。本文报道有关噬菌体抗性菌株的筛选过程及投产情况。     

一株丁二酸高产菌株的筛选和鉴定

从瘤胃中筛选到一株高产丁二酸生产菌株,为革兰氏阴性菌,短杆状,无芽孢,不运动,兼性厌氧.经形态学、生理生化鉴定和基于16S rRNA序列的系统发育分析,该菌株为巴斯德菌科的产琥珀酸放线杆菌,是产琥珀酸放线杆菌CCUG 43843的变种,二者的序列相似性为99.93%,命名为产琥珀酸放线杆菌A3.5L发酵罐分批发酵实验表明,当发酵培养基中葡萄糖浓度为50g/L时,产琥珀酸放线杆菌A3可以产25.8g/L丁二酸,具有较好的丁二酸生产潜力.     

L-鸟氨酸的混合菌种发酵研究

谷氨酸棒杆菌可发酵葡萄糖产L-鸟氨酸。通过连续筛选与驯化筛选到了产量较高的生产菌株CG1006。以GC/MS对发酵液成分的定性分析及鸟氨酸的产量为依据,优化了培养条件,产量从最初的14.346g/L提高到40.416g/L。初步考察了酵母菌CG1006-1对发酵液成分及产量的影响。结果表明混合菌种发酵可纯化发酵液成分。     

一株丁二酸高产菌株的筛选鉴定及初步发酵研究

以牛胃内容物为菌源,利用富马酸钠为唯一碳源并加入高浓度丁二酸钠的选择培养基筛选到一株丁二酸产量较高,副产物较少的菌株。经形态学、生理生化鉴定和16S rDNA序列的系统发育分析,该菌株为巴斯德菌科的产琥珀酸放线杆菌,与琥珀酸放线杆菌S.JST序列相似性最高为98.98%,命名为琥珀酸放线杆菌GXAS137,保藏号为M2011399。利用正交试验对发酵条件进行了初步优化,该菌可发酵55 g/L葡萄糖产38.96 g/L丁二酸,具有较好的丁二酸生产潜力。     

聚γ-谷氨酸高产菌的选育与培养基优化

利用合成培养基为筛选培养基,以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B6-1为出发菌株,经过三轮紫外线诱变和一轮硫酸二乙酯诱变得到了聚γ-谷氨酸高产突变株枯草芽孢杆菌W003,摇瓶液体发酵的聚γ-谷氨酸产量由出发菌株的10.9 g/L提高到20.5 g/L.单因素实验结果表明,该菌产聚γ-谷氨酸的合适碳源为葡萄糖,氮源为硫酸铵.通过正交实验得到了优化的培养基配方,经36h液体发酵,聚γ-谷氨酸产量可达到45.3 g/L.     

一株碱性纤维素酶产生菌的分离、鉴定及酶谱分析

目的:从土样中分离株碱性纤维素酶高产菌株.方法:利用CMC平板初筛,然后利用摇瓶复筛,筛选酶活力高的菌株,对分离出的一株高产菌株进行了鉴定并对其所产酶进行了酶谱分析.结果:获得一株碱性纤维素酶高产菌株H12,酶活力达到1.96U/ml.结论:该菌株呈长杆状、革兰氏染色为阳性、产芽孢;16S rDNA基因序列为1 419bp,与短小芽孢杆菌16S rDNA基因序列具有最高的同源性,基于16S rDNA基因序列的同源性分析以及系统发育分析等方面的多相分类研究,鉴定菌株H12为为短小芽孢杆菌;碱性纤维素酶的酶谱分析只有一条水解条带,酶分子量在75kD左右.     

高产纤维素酶芽孢杆菌的筛选、鉴定与发酵条件优化

纤维素是生产生物质能源最广泛、最廉价的原材料,筛选高活性纤维素酶菌株是纤维素能源开发利用的关键。采用刚果红-CMC平板筛选高产纤维素酶菌株;结合菌株形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定;采用正交实验筛选菌株AF1的最佳产酶发酵条件。筛选获得5株高活力的纤维素酶产生芽孢杆菌,鉴定为2株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、3株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。5株菌的水解圈直径与菌落直径比值均大于4.5,其中解淀粉芽孢杆菌AF1最大达到8.04,优化AF1菌株最佳固体发酵培养基为：玉米秸秆粉20 g, NaCl 0.4 g, CaCl₂ 0.2 g,麸皮32 g,吐温80 0.2 g,蛋白胨0.7 g,(NH₄)₂SO₄ 0.8 g,KH₂PO₄ 0.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.04 g,糖蜜0.4 g,吐温20 0.4 g,水115...     

水浮莲中-株西瓜枯萎病拮抗菌的分离、筛选及鉴定

从水浮莲(Pistia stratiotes L.)的叶中分离出1株对西瓜枯萎病有明显拮抗作用的内生细菌XJPL-YB-26,其发酵液上清在280 nm处有最大紫外吸收峰.利用软件Primer 6.0设计16S rDNA引物并对其基因组DNA进行扩增并测序得到XJPL-YB-26的部分16S rDNA序列.GenBank接收号为EU251191.经 Blastn调出与菌株16S rDNA同源的序列,并用软件MEGA 3.1按Neighbor-Joining方法构建16S rDNA系统发育树.菌株XJPL-YB-26与AB271744处于同一分支,相似性为99%,最终鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.     

水浮莲中一株西瓜枯萎病拮抗菌的分离、筛选及鉴定

从水浮莲(Pistia stratiotes L.)的叶中分离出1株对西瓜枯萎病有明显拮抗作用的内生细菌XJPL-YB-26, 其发酵液上清在280 nm处有最大紫外吸收峰。利用软件Primer 6.0 设计16S rDNA引物并对其基因组DNA进行扩增并测序得到XJPL-YB-26的部分16S rDNA序列, GenBank接收号为EU251191。经Blastn调出与菌株16S rDNA同源的序列, 并用软件MEGA 3.1按Neighbor- Joining方法构建16S rDNA系统发育树。菌株XJPL-YB-26与AB271744处于同一分支, 相似性为99%, 最终鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。     

地衣芽孢杆菌16S rRNA基因的TD-PCR扩增及系统发育分析

运用16SrRNA基因序列分析了中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保存的30株地衣芽孢杆菌的系统发育关系,结果显示:24株菌株位于地衣芽孢杆菌系统发育分支;3株菌株位于蜡状芽孢杆菌-苏云金芽孢杆菌系统发育分支;1株菌株位于枯草芽孢杆菌系统发育分支;2株菌株与其它地衣芽孢杆菌菌株间序列同源性为96.4%~97.4%,明显低于其它地衣芽孢杆菌菌株间同源性,分类地位不明确,有待进一步讨论。通过比较分析16SrRNA基因5′端500bp、3′端500bp以及其全基因的系统发育树,表明16SrRNA基因5′端500bp可以很好的代表全基因序列进行系统发育研究,可用于区分地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及蜡状芽孢杆菌分支。     

HPLC-ELSD法测定枯草芽孢杆菌发酵液中葡萄糖、果糖和蔗糖含量

本文采用HPLC-ELSD法测定枯草芽孢杆菌(Bucillus subtilis)发酵液中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量,结果发酵液中果糖、葡萄糖、蔗糖分别为0.36 mg/m L、0.60 mg/m L、31.36 mg/m L。通过计算,发酵液中蔗糖的转化率约为67.68%,该方法可以准确、灵敏、快速检测枯草芽孢杆菌(Bucillus subtilis)生物转化蔗糖为葡聚糖过程中底物浓度的变化。     

枯草芽孢杆菌产胞苷的初步研究

目的:通过对野生型枯草芽孢杆菌NO122的诱变筛选,选育出胞苷产生菌株。方法:以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株进行紫外线、硫酸二乙酯诱变,经3-脱杂氮尿嘧啶、5-氟胞苷结构类似物平板定向筛选产胞苷突变株;研究碳源、氮源、温度、初始pH值等发酵条件对该突变菌株产胞苷的影响。结果:经诱变传代后得到突变株TZM1012,该突变株在发酵温度37℃、初始pH7.2、摇床转速220r/min的条件下,摇瓶发酵72h,发酵液中的胞苷可达1.873g/L,并具有较好的遗传稳定性。结论:获得产胞苷生产菌株,并具有较好的遗传稳定性。     

药用植物内生芽孢杆菌的多样性和系统发育研究

[目的]了解药用植物内生芽孢杆菌的生物多样性.[方法]采用数值分类、16S rDNA PCR RFLP、BOX-PCR指纹图谱和16S rDNA序列分析技术对分离于几种药用植物的内生芽孢杆菌和已知参比菌株进行表型、遗传多样性及系统发育研究.[结果]供试菌株在数值分类聚类分析中在84%的相似水平上产生13个表观群.16S rDNAPCR-RFLP分析表明供试菌株表现出丰富的遗传多样性.BOX-PCR指纹图谱分析进一步证明药用植物的内生芽孢杆菌的基因组也具有多样性,聚群的结果与数值分类有较好一致性.用软件在Genbank中进行所得序列的同源性检索,并构建系统发育树.由16S rDNA序列分析可知,供试的代表菌株SCAU11与球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)亲缘关系最近,SCAU78和SCAU25为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的两个亚种,代表菌株SCAU39与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的亲缘关系最近.[结论]研究结果表明药用植物内生芽孢杆菌具有明显的表型和遗传多样性.     

黑水虻幼虫肠道和体表产酶细菌的分离和鉴定

从野外收集和室内饲养的黑水虻Hermetia illucens L.幼虫体表和肠道分离出同时具蛋白质和有机磷分解能力的细菌10株,其中编号为T2、T4、T6、T7和T8的菌株分离自体表,编号为S14、S15、S16、S19和S20的菌株分离自肠道。克隆细菌的16S rDNA和DNA促旋酶B亚基编码基因gyrB对10株细菌进行了鉴定。通过16S rDNA序列确定10株菌为芽孢杆菌属,根据gyrB基因以及BLAST结果构建系统发育树,将10株细菌鉴定为枯草芽孢杆菌。然后将10株菌的gyrB基因以B.subtilis subsp.subtilisstr.168和模式菌株B.subtilis subsp.subtilis BCRC10255相应基因序列为参照构建系统发育树,分析10株菌在种的水平上的亲缘关系,发现10株菌存在亲缘关系差异,没有重复菌株。     

一株高产纳豆激酶菌株的鉴定与分析

鉴定高产纳豆激酶菌株Td,分析纳豆激酶的分子特征。利用菌体形态、生理生化特征、以及分子生物学方法对菌株Td进行鉴定;并采用MALDI-TOF质谱测定与分析、SDS-PAGE和纤溶活性测定等方法检测纳豆激酶特性,利用PCR方法扩增纳豆激酶的基因全长。结合菌体形态、生理生化特征和16S r DNA、gyr A基因序列、DNA-DNA杂交率等实验结果,鉴定菌株Td为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis);菌株Td发酵产生的纳豆激酶产量可达300 mg/L以上,占发酵液总蛋白的40%以上;纤溶活性达230 U/m L以上;氨基酸序列与subtilisin E的序列相似性最高;基因全长序列为1 143 bp。枯草芽孢杆菌枯草亚种Td是一株高产、高活性纳豆激酶的产生菌,具有优良的工业化开发价值。     

胞苷生产菌的选育

目的：筛选得到胞苷发酵单位较高的菌株,并对发酵过程作初步研究。方法：以胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌DOS7为出发菌株,对其进行紫外诱变、5-氟胞苷（5FCR＋）和2-杂氮尿嘧啶抗性（2AU＋）抗性筛选。结果：通过紫外诱变和抗性筛选得到突变株DOS7-2-1000-15,抗5-氟胞苷和2-杂氮尿嘧啶的临界浓度分别为800mg/L和1 000mg/L。同时检测了抗5-氟胞苷突变株中CTP合成酶的活性,比原始菌株提高了12.4%,突变株DOS7-2-1000-15发酵过程结果为：36℃发酵72h能积累胞苷最高为3.5g/L。结论：筛选得到的突变株DOS7-2-1000-15的遗传稳定性较好,可稳定发酵。     

响应面法对抑制多杀性巴氏杆菌的枯草芽胞杆菌五倍子发酵液发酵条件的优化

目的利用响应面法对枯草芽胞杆菌AP139与中草药五倍子混合发酵液针对多杀性巴氏杆菌PM2010的抑菌效果进行优化,为畜禽多杀性巴氏杆菌病防治提供参考。方法采用Plackett-Burman设计法对影响枯草芽胞杆菌AP139与中草药五倍子发酵液抑菌效果的8个因子的重要性进行考察,筛选出对抑菌效果具有显著性影响的主效应因素,再通过中心组合设计和响应面分析法确定各显著影响因子的最佳水平。结果优化后的发酵条件为:蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L,NaCl 5g/L,MgSO_4·7H_2O_2.26g/L,五倍子3%,接种量2.04%,温度35℃,培养48h。结论通过响应面法优化后,枯草芽胞杆菌AP139与五倍子发酵液对巴氏杆菌PM2010抑菌圈效果达到了29.8711mm,相对于发酵条件优化前提高了1.92倍。