应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率

慢病毒载体已经广泛应用于动物模型中基因治疗的研究和转基因动物的制备．而准确地测定重组慢病毒的滴度和感染效率是其关键步骤．通过荧光实时定量PCR的方法定量分析重组慢病毒的颗粒数以及病毒的活性滴度,并以GFP报告基因的方法作为对照来验证定量PCR方法的准确性．研究结果显示,应用荧光实时定量PCR法与GFP报告基因法测定得到的病毒活性滴度成正相关,而且前者可以更加准确地测定病毒滴度和病毒感染效率．     

狂犬病病毒 SYBR-Green玉实时荧光定量 PCR 检测方法的建立

狂犬病病毒为不分节段单链负股的 RNA 病毒,属弹状病毒科狂犬病病毒属.世界上几乎所有国家都有狂犬病发生,狂犬病病毒能够使所有温血动物发病致死,死亡率高达100%.本研究根据 GenBank 中的狂犬病病毒 M 基因序列,选择保守区域设计引物,通过对 SYBR-Green玉实时荧光 PCR 反应条件进行优化,建立了用于检测狂犬病病毒的 SYBR-Green玉实时荧光 PCR 方法.结果显示,建立的狂犬病病毒实时荧光定量 PCR 方法,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,是开展狂犬病的临床检测的有力工具.     

埃博拉病毒莱斯顿亚型实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究的目的为建立一种灵敏、快速、定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。首先选择埃博拉病毒莱斯顿亚型的保守基因NP基因作为检测靶目标,筛选出保守序列并设计合成一对特异性引物。然后将连有NP全长基因的重组质粒作为定量标准品,将10倍系列稀释的重组质粒进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、灵敏度及特异性检测。结果显示建立的埃博拉病毒莱斯顿亚型荧光定量PCR检测方法,其灵敏度可达102拷贝/μL,不同梯度标准品间线性关系(R2)达0.997,斜率为-0.3101,扩增效率为110.145%,所有标准品均在79.94℃出现尖且窄的特异性熔解峰。利用该检测系统可以快速定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸,灵敏度高、重复性好,可用于基础及临床实验室对埃博拉病毒莱斯顿亚型感染的快速诊断和临床效果的监测,具有实际的应用价值。     

一种实时荧光定量PCR检测Ⅱ型单纯疱疹病毒检测方法的研究

建立SYBR Green实时荧光定量PCR方法,用于快速、准确检测Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)。设计特异性引物,PCR扩增糖蛋白G(g G)片段,构建p EASY-T1-g G2重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,同时考察该方法的稳定性、灵敏性和特异性,并利用此方法检测HSV-2血清学确诊的生殖器疱疹临床样本。本实验获得的标准曲线R~2=0.997,相关性良好,灵敏度是普通PCR的1 000倍。用本方法检测HSV-2血清学确诊的生殖器疱疹临床样本均为阳性,符合率为100%,且每份样品检测结果的变异系数均小于2%。本研究建立的SYBR Green实时荧光定量PCR方法可用于临床HSV-2感染的检测。     

实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆

针对转基因大豆中普遍含有的35S启动子进行引物设计,以双链DNA染料SYBR GreenⅠ为荧光标记物,利用实时荧光定量PCR方法对大豆样品进行检测。该法检测转基因大豆的检测低限为0.005 nmol/L的35S启动子,线性范围达3个数量级,可快速区分转基因大豆和非转基因大豆,具有快速、简便、灵敏、安全、高通量、低成本等优点,可推广用于转基因植物产品的快速定量检测。     

实时荧光定量PCR

本书在介绍实用荧光定量PCR技术原理基础上,集中论述该技术在各个领域中的应用,包括检测致病菌、病毒检测、检测基因突变和临床、遗传病研究、肿瘤研究、环境微生物检测、动物学研究、基因表达检测和流行病学等。     

实时荧光定量PCR

<正>化学工业出版社出版本书在介绍实用荧光定量PCR技术原理基础上,集中论述该技术在各领域中的应用,包括检测致病菌、病毒检测、检测基因突变和临床、遗传病研究、肿瘤研究、环境微生物检测、动物学研究、基因表达检测和流行病学等。书号:978-7-122-15695-2开本:16开定价:79.00元出版日期:2013年5月     

实时荧光定量PCR的数据分析方法

实时荧光定量PCR是目前检测目的核酸拷贝数及分析靶基因在mRNA表达水平相对变化的主流技术。研究表明,分析结果的准确性依赖于数据分析方法的可靠性。我们简要综述实时荧光定量PCR的数据分析方法。     

玉米黑粉菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立利用实时荧光定量PCR对玉米黑粉菌[Ustilago maydis(DC.)Corda]快速定量检测的方法。方法:以玉米黑粉菌βactin基因为内参基因,以含有βactin基因的具浓度梯度pMD19 T-Simple质粒为标准品,接种黑粉菌后不同时间点的玉米叶片作为样本用以检验该方法的实用性。结果:建立了利用实时荧光定量PCR对玉米黑粉菌进行定量分析的方法。该方法重复性好、特异性强、灵敏性高,对玉米黑粉菌的最低检出率为19拷贝/反应,可以准确检测经注射接种后1 d的玉米叶片中的黑粉菌量。结论:建立的实时荧光定量PCR方法可用于玉米黑粉菌菌量的检测。     

一种检测马尔尼菲青霉菌实时荧光定量PCR方法的建立和应用

目的:建立一种检测马尔尼菲青霉菌的实时荧光定量PCR的方法。方法:针对马尔尼菲青霉菌5.8S rRNA设计特异性PCR引物,采用核酸荧光染料SYBR GreenⅠ进行实时荧光定量PCR检测,探讨该方法的灵敏度和特异性,并进行临床样品检测验证。结果:该方法的特异性较好,与该菌属内的其他细菌间无交叉反应;灵敏度可检测出10个细胞/mL全血,在检测范围内线性良好,相关系数R2=0.981。临床样品检测和传统的培养方法结果完全相符。结论:该方法特异性好,灵敏度高,操作简单,检测时间短;临床样品检测具有很好的准确性,从本研究的结果显示实时荧光定量PCR方法在检测马尔尼菲青霉菌中的应用可以大大缩短临床的诊断时间,提高临床诊断的准确度和效率。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF4基因序列设计一对特异性引物,通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的标准曲线,并进行熔解曲线分析。结果显示:建立的EvaGreen实时荧光定量PCR特异性强,与其他非靶标病毒基因不发生交叉反应;灵敏度高,最高可检测到10拷贝/μL的病毒量;重复性好,3个浓度的批间和批内的变异系数均小于2.5%;对118份临床样品进行检测,阳性样品25份,阳性率为21.2%,检测结果与普通PCR相符率为99.2%,其中一份样品经荧光PCR检测为PCV2阳性,普通PCR检测为阴性。结果表明,建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、简便快捷等特点,可用于临床PCV2感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

H13亚型禽流感病毒以往只在海鸥、鸭等水禽中被发现,2018年,我们实验室报道了蛋鸡感染H13亚型禽流感病毒的证据,表明H13亚型禽流感病毒存在从水禽中溢出感染陆禽的风险,因而有必要加强对H13亚型禽流感病毒的监测。实时荧光定量PCR由于具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点,在病原监测工作中得到了广泛应用。本研究以H13亚型禽流感病毒的HA基因作为靶基因,设计了一对特异性荧光定量PCR检测引物,通过特异性试验、敏感性试验等,建立了H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法,并应用建立的检测方法对海鸥粪便样品进行核酸检测。实验结果发现,该检测方法的灵敏度为1.60×10⁰拷贝/μL;该检测方法对H1、H3、H5、H6、H7和H9等6个亚型的禽流感病毒无交叉反应;该检测方法的敏感性是常规PCR的10倍;海鸥粪便样品中H13亚型禽流感病毒的核酸检测阳性率为18.8%。我们建立的H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点,该检测方法可用于大量临床样品的快速检测,为H13亚型禽流感病毒监测工作的顺利开展提供了技术支撑。     

枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的:建立枣疯病植原体拷贝数检测实时荧光定量PCR方法,为枣疯病植原体定量检测提供技术支持。方法:构建质粒标准品,设计实时荧光PCR探针引物,优化体系,建立标准曲线,并进行重复性验证。结果:制备了枣疯病植原体标准质粒,建立了稳定的质粒标准品检测体系(R2=0.998,检测限10拷贝,定量限100拷贝)。结论:实时荧光定量PCR检测方法重复性好,可用于枣疯病植原体的拷贝数检测,为枣疯病植原体检验检测和病害防治提供了技术支持。     

季节性流感病毒H1N1实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速定量检测季节性流感病毒H1N1核酸的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。方法选择季节性流感病毒H1N1的保守基因NP基因作为检测靶目标,应用Clustal W软件进行序列同源性比对分析,筛选出季节性流感病毒H1N1特异性的保守序列作为引物候选区域,然后应用Primer Express及PrimerPremier 5.0软件包对候选引物进行进一步配对及筛选,得到最优特异性检测引物。同时,由病毒全长cDNA扩增出NP基因,琼脂糖凝胶电泳检测NP基因的扩增情况并对目的条带进行切胶回收及纯化,对回收后的NP全长基因进行核酸浓度测定,并换算成拷贝数,作为定量标准品。结果应用ABI公司的Power SYBR Green PCR MasterMix及StepOne实时荧光定量PCR仪,该检测系统灵敏度可达102 copies/μL,不同梯度标准品间线性关系（R2）达0.999,斜率为-0.3433,扩增效率为95.572%,所有标准品均在83.2℃出现尖且窄的特异性熔解峰。结论利用该检测系统可以快速定量检测季节性流感病毒H1N1,灵敏度高,可用作基础及临床实验室对季节性流感病毒H1N1感染的辅助诊断方法和临床效果的监测手段,对实验操作者要求相对较低,具有实际的应用价值。     

实时荧光定量PCR快速检测四种蛀果性害虫

苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫及地老虎是危害新疆香梨等产品的重要害虫,前3种也属于国际上检验检疫重要虫害。目前,国内主要依靠虫体的形态特征对其进行鉴定,缺少分子生物学检测手段,这限制了我国香梨等产品的生产和出口贸易发展。首先得到这4种害虫的16S r DNA COI基因片段,在差异序列设计特异性的引物和探针,利用实时荧光定量PCR技术建立快速分子检测试验体系,依据标准曲线分析检测体系的重复性和灵敏性。结果表明,苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫及地老虎最低检出限分别在1.605×10-2、0.729×10-2、0.475×10-2和0.818×10-2 ng/μL,满足检验检疫日常检测需求。为克服实际检测过程中经常会出现某一虫的残片样本或者几种虫聚集在一起的混合样本,使用了单头、多头DNA样本及4种害虫的混合DNA样本进行检测分析,进一步验证了该方法的特异性,可靠性和可适用性。     

拟南芥CHS 基因表达的实时荧光定量PCR 检测

在简要介绍实时荧光定量PCR反应和定量原理的基础上, 采用TaqMan荧光定量PCR技术, 研究了UV-B辐射对拟南芥(Arabidopsis thaliana)CHS(查耳酮合成酶基因)表达的诱导, 获得了与传统Northern杂交一致的结果。实时荧光定量PCR用于基因表达的定量检测, 具有特异性强、自动化程度高、高效快捷, 避免使用放射性同位素, 能同时对多个样品中的起始模板进行准确定量等特点, 因此该方法已逐渐被广泛用于基因表达的定量分析。