靶向白介素-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系的构建

目的：构建针对IL-1α基因的shRNA表达载体,筛选能够抑制Hela229细胞内源性IL-1α表达的shRNA,建立无内源性IL-1d表达的Hela229稳定细胞系.方法：根据shRNA的设计原则,以IL-1 αcDNA oligo为模板设计一段21 bp核苷酸目标序列,构建成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制IL-1α基因的重组shRNA质粒,转染Hela229细胞,经G418筛选后获得单克隆稳定细胞株,用ELISA方法在蛋白水平上检测IL-1α基因的沉默效果.结果：经酶切鉴定和测序分析确定IL-1 α-shRNA重组质粒构建正确,ELISA筛选出能够显著抑制内源性IL-1α表达的shRNA,获得沉默内源性IL-1 α表达的单克隆稳定的Hela229细胞株.结论：靶向IL-1α基因的重组shRNA表达质粒可显著抑制Hela229细胞内源性IL-1α的表达,成功构建靶向IL-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系.     

大鼠STIM1基因真核表达载体构建及蛋白表达定位

[目的]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞中表达、定位。[方法]应用基因合成方法获得STIM1基因序列,克隆至携带EGFP标签的真核表达载体p EGFP-C_1、p IRES_2-EGFP,经菌落PCR、酶切、测序鉴定后,转染至A7r5细胞,Western Blot检测蛋白表达,激光共聚焦观察其定位。[结果]STIM1全长2 058 bp,重组载体经酶切、PCR、测序鉴定构建正确,在A7r5细胞内高表达,并主要定位于细胞质。[结论]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞质中表达,为建立稳定高表达细胞系及后续功能研究奠定基础。     

B19病毒XA株VP1独特区蛋白对Hela细胞凋亡的影响

目的:构建B19病毒XA株VPlu基因的真核表达载体和稳定转染细胞系,探讨B19病毒XA株VPl独特区蛋白对Hela细胞凋亡的影响。方法:采用本课题组前期构建的真核表达载体plRES2-EGFP-Vplu及plRES2-EGFP对照质粒,将其稳定转染至Hela细胞,通过流式细胞术检测EGFP阳性细胞的比例以确定稳定转染的细胞系是否成功构建;提取稳定转染的Hela细胞的总蛋白,通过Western blot检测细胞内凋亡相关基因Caspase3的表达;转染plRES2-EGFP-Vplu及plRES2-EGFP的Hela细胞经过Annexin V和PI的染色后,通过流式细胞术检测其凋亡率。结果:本实验成功构建了plRES2-EGFP-VPlu稳定转染的Hela细胞系,plRES2-EGFP-Vplu稳定转染的Hela细胞中Caspase3的表达较转染对照质粒的Hela细胞明显增加,细胞凋亡率亦显著升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:B19病毒XA株VP1独特区蛋白能够显著促进Hela细胞的凋亡。     

非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达

[目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。     

无标记转Fat-1基因真核表达载体的构建及转基因绵羊细胞系的建立

为了建立无筛选标记基因的转Fat-1基因绵羊细胞系,本研究将PCR克隆得到的Fat-1基因,合成的attB、Loxp序列并克隆入pN1-EGFP框架载体,得到可删除筛选标记基因的pEGFP-N1-Fat-1真核表达载体。体外转录合成phiC31整合酶mRNA并与线性化的pEGFP-N1-Fat-1载体共转染绵羊胎儿皮肤成纤维细胞,G418筛选得到表达绿色荧光的单克隆,再利用pET-28a-His-NLS-TAT-Cre质粒诱导Cre重组蛋白表达,将纯化后的Cre穿膜肽转导表达绿色荧光的单克隆细胞,将荧光淬灭的细胞系扩繁,提取基因组DNA,进行PCR及测序鉴定,得到无标记转Fat-1基因绵羊胎儿皮肤成纤维细胞系,为生产无筛选标记基因的转基因绵羊奠定基础。     

人Notch信号通路中Jagged1基因的克隆与真核表达

[目的]克隆人Notch信号通路中配体Jagged1基因并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR的方法从Hela细胞总RNA中获取Jagged1基因,并克隆至携带FLAG标签的真核表达载体pCMV-Tag4。经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒Jagged1-pCMV-Tag4瞬时转染HEK 293T细胞,通过Q-PCR和Western blot检测目的蛋白的表达。[结果]成功构建了真核表达质粒Jagged1-pCMV-Tag4并在HEK 293T细胞中瞬时表达。[结论]Jagged1在HEK 293T细胞中实现瞬时表达,为稳定表达和进一步研究Jagged1/Notch信号通路奠定基础。     

人GNAS1基因克隆、真核表达载体的构建及瞬时转染Hela细胞

目的:克隆人GNAS1基因编码区序列、构建真核表达载体并瞬时转染Hela细胞。方法:通过RT-PCR克隆GNAS1基因编码序列,亚克隆至pMD19载体,测序鉴定正确后,通过酶切连接至真核表达载体pEGFP-N1,通过菌液PCR和酶切鉴定获得pEGFP-GNAS1重组质粒;表达载体以Lipofectamine2000介导转染Hela细胞,并用实时定量PCR检测外源基因在Hela细胞中的表达。结果:克隆到GNAS1基因并获得了pEGFP-GNAS1表达载体,在Hela细胞中获得了GNAS1的过量表达。结论:成功克隆了GNAS1基因编码序列,并构建其真核表达载体,瞬时转染至Hela细胞,为进一步深入研究Gsα蛋白生物学作用奠定基础。     

microRNA-145表达对宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨微小核糖核酸145(micro RNA-145)表达对宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响。方法:实验室常规培养宫颈癌Hela细胞并分为4组,空白(Blank)组(Hela细胞+RPMI1640)、micro RNA-145组(Hela细胞+RPMI1640+micro RNA-145-5p mimics)、阴性序列(NC)组(Hela细胞+RPMI1640+NC)、Mock组(Hela细胞+RPMI1640+Lipofectamine 2000),记录各组Hela细胞转染率,采用实时荧光定量聚合酶链锁反应(QRT-PCR)检测各组Hela细胞中micro RNA-145的表达水平,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测Hela细胞增殖情况,采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法判断Hela细胞凋亡情况。结果:本研究中,各组Hela细胞转染率均80%;micro RNA-145组micro RNA-145的表达显著高于Blank组、NC组和Mock组,差异有统计学意义(P0.05)。转染24 h、48 h、72 h后,micro RNA-145组490 nm波长处的光密度值(OD490值)较转染0h后明显降低,转染48 h、72 h后,Blank组、NC组、Mock组OD490值较转染0 h后时明显升高,转染24 h、48 h、72 h后,micro RNA-145组OD490值均低于Blank组、NC组、Mock组,差异有统计学意义(P0.05)。DAPI染色后,micro RNA-145组Hela细胞凋亡率高于Blank组、NC组、Mock组,差异有统计学意义(P0.05)。转染后,Blank组、NC组、Mock组的micro RNA-145表达率、OD490值、DAPI染色后Hela细胞凋亡率比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论:micro RNA-145表达上调可抑制宫颈癌Hela细胞增殖,并促进Hela细胞凋亡,通过药物调控micro RNA-145表达有望成为宫颈癌治疗的新靶点。     

MIC3-EGFP融合蛋白真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建以绿色荧光蛋白(greenfluoreseeneeprotein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C2-MIC3并检测MIC3-EGFP融合蛋白其在COS-7细胞中的表达及定位.方法:通过基因重组的方法构建pEGFP-C2-MIC3重组真核表达质粒,并通过酶切和基因测序鉴定.脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,转染后24h在活细胞状态下用倒置荧光显微镜直接观察MIC3-EGFP融合蛋白在COS-7细胞中的分布.结果:PCR检测,酶切鉴定及测序证实目的基因MIC3正确连接到pEGFP-C2的多克隆位点.pEGFP-C2-MIC3重组体转染COS-7后,在细胞质表达.结论:成功地构建了pEGFP-C2-MIC3融合蛋白真核表达质粒,在COS-7细胞中获得表达.     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

Stathmin SiRNA表达载体抑制stathmin的表达

目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8％,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达.     

Pmscv-Ubc9逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的：构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法：聚合酶链反应（PCR）扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果：限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论：携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

Pmscv-Ubc9 逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

EGFP-Luc-Hepa1-6细胞系的构建及其在小鼠肝癌模型中的应用

目的:构建带有增强型绿色荧光蛋白EGFP及荧光素酶luciferase的真核表达载体p CMVLuciferase-IRES2-EGFP,对肝癌细胞系Hepa1-6转染后进行稳定筛选,并将表达该载体的细胞系应用于小鼠原位肝癌模型构建,以对小鼠肝癌细胞进行稳定标记与活体示踪。方法:对p GL3-Basic质粒进行Xba I酶切、Klenow片段补平黏端、Xho I酶切获得luciferase小片段,与Xho I/Sma I酶切p IRES2-EGFP质粒获得的载体大片段连接,获得重组质粒p CMV-Luciferase-IRES2-EGFP。酶切鉴定、测序比对确认序列完全正确后,以重组载体转染Hepa1-6细胞进行稳定筛选,以荧光显微镜观察EGFP表达,报告基因实验与LuminaⅡ成像系统检测荧光素酶活性。确认该细胞系中的质粒得到表达后,以该细胞系进行C57BL/6小鼠肝脏原位接种构建肝癌模型,以LuminaⅡ成像系统连续活体监测肝癌的生长,取离体的肝癌组织制备石蜡切片(HE染色)和冰冻切片(免疫荧光染色)分别观察离体肿瘤组织病理学特征及其中肝癌细胞绿色荧光蛋白表达情况。结果:成功构建表达p CMV-Luciferase-IRES2-EGFP载体的Hepa1-6细胞系(EGFP-Luc-Hepa1-6),并以该细胞系成功构建C57BL/6小鼠原位肝癌模型,实现小鼠肝癌细胞的活体示踪与体外标记。结论:成功构建EGFP-Luc-Hepa1-6细胞系,且以此细胞系构建的小鼠原位肝癌模型可以同时实现小鼠肝癌生长的连续活体监测与离体组织检测。     

MMP-7基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达与鉴定

目的：构建MMP-7基因真核重组质粒,检测并鉴定MMP-7在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法：提取宫颈癌组织总RNA,通过基因克隆构建MMP-7基因真核表达重组质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7,酶切、PCR及基因测序鉴定,用阳离子脂质体介导采用基因转染技术转染人宫颈癌Hela细胞,RT-PCR检测外源基因的表达、间接免疫荧光法检测对表达产物进行鉴定。结果：成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7并转染了人宫颈癌Hela细胞,通过RT-PCR可以检测到MMP-7 mRNA在Hela细胞中的表达,经间接免疫荧光反应可检测到明显的阳性反应,而转染空载体组表达阴性。结论：构建的重组质粒pcDNA3.1（＋）/MMP-7能在Hela细胞中表达,为该蛋白在人子宫癌后续的功能研究奠定了基础。     

重组人PCNA突变体的克隆与稳定表达

目的:构建重组人PCNA突变体(mutant PCNA,mPCNA)的真核表达质粒,并建立稳定高表达该目的蛋白的宫颈癌细胞系Hela.为进一步研究PCNA在DNA损伤修复中重要的生物学功能奠定基础.方法:将舍有定点突变的PCNA cDNA序列克隆到T载体中,然后再亚克隆到真核表达栽体pCDNA3.1/V5-His A上,构建真核表达载体质粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA,稳定转染到Hela细胞中;Western Blotting法检测蛋白的表达情况;白细胞记数法测定细胞的生长速率.结果:真核表达质粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA经酶切、测序分析与实验设计的序列完全一致;稳定建系后,Western Blotting结果显示在相应位置可见清楚的目的条带;稳定高表达mPCNA的细胞系与野生型细胞相比两者的生长速率基本一致.结论:成功构建了真核表达质粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA;建立了稳定高表达该突变体的Hela细胞系;PCNA突变体的高表达不影响Hela细胞的正常生长.     

大鼠μ型阿片受体的pIRES2-EGFP质粒构建及其在HEK293细胞中的表达

提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增μ型阿片受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,纠正点突变后,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,测序及酶切结果表明μ基因正确,μ-pIRES2-EGFP质粒构建成功.用脂质体法将μ-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光,应用免疫组化荧光可以观察到μ基因的高强度表达.     

大鼠大麻素Ⅰ型受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠大麻素型Ⅰ受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体并观察其在细胞中的表达。方法:大鼠CB1基因序列设计引物,以大鼠脑组织为模板扩增CB1基因编码区片段,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N3中,构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,通过观察EGFP报告基因的表达以及免疫荧光,Western Blot方法鉴定CB1可在真核细胞中过表达情况。结果:构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP,单双酶切和测序验证正确。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞膜表达。免疫荧光试验也证明重组载体转染后,CB1基因和GFP共同定位于胞膜部分。Western Blot实验证明表达CB1蛋白。结论:成功构建了高表达的CB1-EGFP融合蛋白真核表达载体。     

C反应蛋白真核表达质粒的构建、表达及其对小鼠血管平滑肌细胞TNF-α表达的影响

目的构建小鼠C-反应蛋白基因重组质粒pIRES-CRP,观测其对血管平滑肌细胞TNF-α表达的影响。方法用RT-PCR法,以小鼠肝组织RNA为模板,扩增获得编码C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的全长基因。将CRP基因克隆入真核表达质粒pIRES中,构建重组真核表达质粒pIRES-CRP。将重组质粒转染HeLa细胞,通过RT-PCR法检测CRPmRNA的表达,Western blot检测CRP蛋白的表达。将阳性质粒转染小鼠血管平滑肌细胞,通过Western blot检测CRP对TNF-α表达的影响。结果经酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明,所克隆的CRP基因与报道结果完全一致,重组体的连接方向正确,阅读框与预期完全一致,真核表达质粒pIRES-CRP构建成功。将重组质粒pIRES-CRP瞬时转染Hela细胞,通过RT-PCR和Western blot证实CRP基因得到表达。将阳性质粒转染小鼠血管平滑肌细胞,TNF-α的表达明显高于空白对照组和空载体组(P<0.01)。结论成功构建小鼠CRP基因重组质粒pIRES-CRP,CRP基因能在人子宫颈癌Hela细胞中正常转录和翻译,表达的蛋白能与CRP的特异抗体反应。CRP能明显上调小鼠血管平滑肌细胞TNF-α的表达,这为解释CRP在冠状动脉的形成过程中起着促炎作用提供了新的实验依据。