基于单链DNA开关调控的多功能生物电路

合成生物电路在生物传感及生物计算方面成为了广泛应用的工具。工程化生物电路系统具有良好的灵活性,同时也具备模块化的特征。在本文中,研究了基于单链DNA开关调控的多功能生物电路的构建方法。通过将计算机辅助设计的单链DNA开关作为核心控制元件,并利用长度为20 bp的toehold区域来激活单链DNA开关,驱动了简单的单向式、循环式以及级联的多层次的生物电路系统。在级联式电路系统中,通过调整单链DNA开关的结构,使信噪比从2.996变成5.274。同时,单链DNA开关作为长单链DNA（784 bp）的一部分,在无细胞蛋白质系统中实现了基因表达调控。因此,本文研究的工程化方法为今后复杂的人工生物电路的构建提供了坚实的技术基础。     

一种核糖体展示单链抗体文库的构建与鉴定

用柑桔溃疡病致病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri（Xac）全菌免疫小鼠,提取小鼠脾细胞mRNA,RT-PCR扩增小鼠抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）,采用linker (Gly4Ser)3连接VH和VL,构建用于核糖体展示方法筛选阳性单链抗体（scFvs）的文库。通过将scFv文库DNA转化大肠杆菌JM109,随机挑取克隆子测序以分析单链抗体文库的多样性。结果显示,用柑桔溃疡病菌免疫后的小鼠抗血清效价为2500倍左右,扩增的VH大小为350bp左右,VL的大小为650bp左右,linker连接后的单链抗体文库DNA大小为1200bp左右。测序结果显示,单链抗体文库多样性好。以Xac为靶,筛选到了抗Xac的特异性抗体,说明该抗体库可用于柑桔溃疡病菌单链抗体的筛选。     

古DNA单链测序文库的建立与检测北大核心CSCD

2005年问世的第二代测序技术在古DNA领域的应用,突破了第一代测序技术在绝灭或死亡生物全基因组获取手段上的局限。借助古基因组信息,研究者能够从更为系统的实时分子证据角度,解读诸如人类起源、大型绝灭哺乳动物迁移演化、动植物家养驯化以及早期人类社会生活模式等古生物学、遗传学与演化生物学问题。引入第二代测序技术之后,传统的古DNA研究方法及流程得以改变,剔除了原有的实验流程中耗时的分子克隆步骤,引入了与第二代测序技术紧密相关的古DNA单链测序文库构建环节。古DNA单链测序文库的构建,是将古DNA双链模板变性成单链后,通过向单链古DNA两端添加人工DNA片段,将古DNA分子转变成能被测序仪识别的文库分子。针对古DNA分子微量、高度片段化以及普遍存在碱基损伤的特点,古DNA单链测序文库,能够高效获取古DNA材料中的遗传信息。本文系统介绍古DNA单链测序文库建立流程,以及对文库质量进行检测的方法,为研究者运用第二代测序技术测定绝灭或死亡生物全基因组提供方法借鉴。     

古DNA单链测序文库的建立与检测

2005年问世的第二代测序技术在古DNA领域的应用,突破了第一代测序技术在绝灭或死亡生物全基因组获取手段上的局限。借助古基因组信息,研究者能够从更为系统的实时分子证据角度,解读诸如人类起源、大型绝灭哺乳动物迁移演化、动植物家养驯化以及早期人类社会生活模式等古生物学、遗传学与演化生物学问题。引入第二代测序技术之后,传统的古DNA研究方法及流程得以改变,剔除了原有的实验流程中耗时的分子克隆步骤,引入了与第二代测序技术紧密相关的古DNA单链测序文库构建环节。古DNA单链测序文库的构建,是将古DNA双链模板变性成单链后,通过向单链古DNA两端添加人工DNA片段,将古DNA分子转变成能被测序仪识别的文库分子。针对古DNA分子微量、高度片段化以及普遍存在碱基损伤的特点,古DNA单链测序文库,能够高效获取古DNA材料中的遗传信息。本文系统介绍古DNA单链测序文库建立流程,以及对文库质量进行检测的方法,为研究者运用第二代测序技术测定绝灭或死亡生物全基因组提供方法借鉴。     

分子信标在DNA生物传感器中的应用

DNA传感器是基于DNA分子相互作用原理设计而成的一种新型的检测技术,具有快速,简单等优点,在基因分析及其他应用领域已显示出越来越重要的价值.分子信标是一种具有发卡式结构的寡核苷酸,由于其能够很好地识别单碱基错配序列,基于发卡式DNA的传感器较传统的单链DNA传感器有更好的检测特异性,目前得到广泛的研究.本文介绍了DNA生物传感器及分子信标的有关原理,并着重介绍了发卡式DNA的结构及其在DNA生物传感器中的应用.     

所有生物的DNA都具有双螺旋结构吗?

DNA是主要的遗传物,通过控制蛋白质的生物合成来控制性状的遗传.大多数生物的遗传物质是双链的DNA,有的是单链的RNA,极少数病毒的遗传物质是单链DNA.现已发现的单链DNA病毒有:动物的小DNA病毒、植物的双生病毒、X_(174)噬菌体等,它们的遗传物质都是单链DNA.前两者的DNA为线状分子,后者的为环状分     

端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

基于重组酶和终止子的状态调控开关设计

合成生物学研究常用基因开关来调控细胞的状态以实现相应功能。已有的基因开关往往需要持续的输入信号来维持特定的开关状态,开关功能的维持需要持续消耗能量,并且对扰动较为敏感。文中利用了位点特异性重组酶的倒位效应反转终止子,构建了一种转录层次的状态调控开关,使得脉冲信号即可触发开关状态改变,并在下一次信号来临前稳定维持当前状态。应用自下而上的工程化思想,文中先后对重组酶和终止子进行了单独表征和组合表征,探究了二者之间的相互影响,筛选出了相互兼容的组合,成功实现了细胞的单次、二次状态切换。最后,此开关成功地被用于构建生物七段译码器,显示出了其较好的应用潜力。     

外泌体和miRNA在川崎病中的研究进展

外泌体(exosome)是一类径在30～150 nm之间、具有脂质双层膜结构的微小囊泡.生物体内多数细胞都可以分泌外泌体,外泌体可在细胞之间起传递遗传信息的作用,其携带的蛋白质、DNA、RNA等可被受体细胞所摄取并发挥作用.MiRNA作为内源基因编码单链核苷酸分子,可参与体内基因的表达调控,同时在外泌体中也广泛存在.川...     

端粒、端粒酶结合因子hPinxl基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

单链莫内甜蛋白基因的合成及其植物表达载体的构建

目的:合成单链莫内甜蛋白基因,构建其植物表达载体。方法与结果:根据已报道的单链莫内甜蛋白的氨基酸序列及甜味机理,重新设计合成了全长294bp的莫内甜蛋白基因,其中单链莫内甜蛋白氨基酸序列中的Asp69(原AspA16)突变为Asn。利用DNA重组技术,将莫内甜蛋白基因克隆到植物表达载体pBl221中,构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体pBI221-monellin。结论:构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体,为转化园艺植物以改善其口感奠定了基础。     

SSB蛋白的高效表达及其与ssDNA的相互作用

大肠杆菌单链结合蛋白SSB在DNA复制、重组和修复中起着重要作用。为研究单链结合蛋白SSB的体外生物功能构建了融合蛋白SSB的表达载体并使其高效表达及易于纯化。ssb基因片段是以E.coli K-12基因组为模板经PCR扩增获得,并通过基因的体外拼接成功构建了表达载体pQE30-ssb。重组菌株M15/ pQE30-ssb经过IPTG的诱导表达了蛋白SSB。收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS-PAGE分析,结果表明有一与预期分子量（20.6 kD）相应的诱导表达条带出现,其表达量约占全细胞蛋白的30％且以可溶形式存在。利用固定化金属离子（Ni2+）配体亲和层析柱纯化融合蛋白SSB,其纯度达到90％。通过凝胶层析和等离子共振技术对SSB的生物功能进行了系统研究分析。结果表明,SSB蛋白以四聚体形式与单链DNA分子结合,其亲和力常数（KD）为4.79×10-7 M。     

Streptomyces rimosus M4018 中氧化应激转录抑制因子Rex的克隆表达及与rex 操纵子的体外结合活性

【目的】为了研究龟裂链霉菌Streptomyces rimosus M4018中的rex基因对自身rex operator(ROP)的调控机制。【方法】根据天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)中rex基因的同源序列设计引物进行PCR,从S.rimosus M4018中获得其rex基因(Sr-rex)。同时,通过染色体步移的方法,获得其上游的ROP序列。采用体外凝胶迁移的方法,分析了Sr-Rex对ROP的调控作用。【结果】获取的Sr-rex基因核苷酸序列长度为846 bp,预测的编码氨基酸序列与S.coelicolor A3(2)中Rex的同源性为84%,获得GenBank登录号:GQ849479。圆二色光谱显示Sr-Rex的结构以α螺旋和β折叠为主,与软件预测相符。凝胶迁移实验表明,Sr-Rex能与S.rimosus M4108中扩增到的ROP片段特异性结合。同时,以Rex:ROP的最小结合序列为基础,设计了一条22 bp的单链DNA片段,和Sr-Rex的最大结合摩尔浓度比约为5:1。高浓度的NADH抑制两者的结合活性,而NAD+对结合没有影响。【结论】在S.rimosus M4108中,Rex是通过响应胞内NAD(H)水平的方式来调控ROP的表达的。     

DNA甲基转移酶RNAi干涉载体的构建及其鉴定

DNA甲基化(DNA Methylation)是真核生物基因组最常见的DNA共价修饰形式,影响蛋白质-DNA的相互作用,在基因表达的调控上起着重要作用,RNAi(RNA interference)干涉是关闭特定基因功能的新技术,在植物功能基因组、植物发育及生理代谢途径调控等方面有着广泛应用.本文根据植物DNA甲基转移酶(DNMTs)的保守序列设计引物,首先从拟南芥总基因组DNA中克隆出DNA甲基转移酶基因保守片段,然后以此保守片段为模板扩增长度约570bp,的靶序列用于构建RNAi载体.根据RNAi作用机制,将570bp靶序列正向、反向连接到pHANNIBAL载体上,然后将带有此反向重复结构的完整OFF框连接到植物表达栽体pGreell上,经过酶切鉴定和测序分析证实DNA甲基转移酶RNAi重组表达载体构建成功.转化红豆衫细胞表明该干涉载体具有生物学功能,为研究受DNA甲基化调控的性状改良打下基础.     

小鼠IL-39的克隆及真核表达载体的构建北大核心

[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。     

小鼠IL-39的克隆及真核表达载体的构建

[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。     

DNA氧化性损伤与端粒缩短

末端复制问题（the end replication problem）不能完全解释端粒在某些细胞分裂过程中迅速缩短的现象.40％的高压氧下细胞传代次数降低,端粒缩短速率增大,细胞出现衰老特征,端粒DNA上单链断裂积累.推测端粒缩短的主要原因在于衰老过程中或氧胁迫下端粒DNA单链断裂增多,使端粒末端单链片段在DNA复制时丢失.端粒酶和活性氧对端粒长度的正负调控作用的准确机制还有待于更深入的研究.     

从噬菌体抗体库中淘选血纤维蛋白特异的单链抗体

为构建小鼠噬菌体抗体库 ,以获得对人血纤维蛋白特异的抗体 ,由小鼠脾脏提取 m RNA,经反转录 PCR扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段 ,将二者和一段编码十五肽 (Gly4 Ser) 3的 DNA接头借助重组 PCR组装成为单链抗体 (single- chain antibody,Sc Ab)基因 .将单链抗体基因插入噬菌体展示载体 p CANTAB- 5E,通过电击法转化大肠杆菌 TG1细胞 ,用辅助噬菌体 M1 3K0 7超感染 ,构建了库容量在 1 0 8以上的噬菌体单链抗体库 .利用亲和选择方法 (淘选 ) ,从噬菌体抗体库中选得血纤维蛋白特异的单链抗体 .模拟抗体成熟过程 ,用 DNA改组 (DNA shuffling)技术使抗体基因重新组合 ,构建新的改组抗体库 ,并从中选择到提高了亲和力的噬菌体单链抗体 .抗体基因在大肠杆菌中表达 ,表达蛋白经 Sephadex G- 75柱层析分离 ,得到初步纯化的单链抗体蛋白 .     

构建合成生物学制造厂

合成生物学是一个"自上而下",以设计-构建-测试循环为研究模式、以工程化组装构建为特征的新兴跨学科领域.近年来在此新兴领域的众多研究成果使该研究循环获得了极大的成功,特别是在基于计算机的生物系统设计、DNA从头合成、组装及验证,以及代谢产物分析等方面为建立未来高通量生物系统加工生产线打下了坚实的基础.本文旨在总结当前合成生物学的技术发展水平,并对建立自动化生物产品制造厂需要应对的挑战展开讨论.     

表观遗传学研究的模式生物——粗糙脉孢菌

丝状真菌粗糙脉孢菌是一种作为遗传学研究的经典模式生物.通过对粗糙脉孢菌5S r RNA基因的组成和在染色体上分布的研究,揭示了丝状真菌中存在的一种基因组防御机制——重复序列诱导的DNA点突变(RIP).通过对发生突变的5S r RNA假基因的研究还发现,粗糙脉孢菌中存在一种重要的表观遗传修饰——DNA甲基化,随后的深入研究使粗糙脉孢菌成为解析DNA甲基化机制的最重要模式生物之一.粗糙脉孢菌基因转化操作引起的营养生长阶段同源基因的沉默(quelling)是由RNAi途径调控的,同时该途径也是调控减数分裂过程中非配对DNA诱发的基因沉默(meiotic silencing)的关键.由于粗糙脉孢菌基因组简单,且存在与高等真核生物相同的DNA甲基化和多种组蛋白的修饰,使其成为今后深入研究组蛋白修饰与染色质重塑等表观遗传现象参与基因表达调控和基因组稳定性维持的重要模式生物之一.