信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响

乙醇氧化酶启动子被分离、克隆 ,并建立了转化方法后 ,毕赤酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。为了进一步提高外源蛋白质的分泌表达 ,对信号肽序列进行了研究。首先按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因子信号肽序列MF4I,随后在MF4I信号肽序列的N端分别引入 1～ 10个毕赤酵母Aox1蛋白质的N端氨基酸 ,构成 10种不同的分泌信号肽序列 ,10种不同的分泌信号肽序列被用于植酸酶基因的毕赤酵母分泌表达。以上新的信号肽序列都可使植酸酶的分泌表达量增加 ,而以N端增加A、I、P三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大 ;和野生型的酿酒酵母α因子信号肽序列相比 ,使植酸酶分泌表达量增加 5倍 ,摇瓶中植酸酶的分泌表达量为 90mg/L。此外在MF4I信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了EEAEAEAEP和K共 10个氨基酸 ,进一步提高信号肽的分泌效率 ,使表达又提高约 35 % ,使得摇瓶中酸性植酸酶的表达量达到 12 0mg/L ,是pPCI9K表达量的 8倍。     

枯草杆菌启动子－信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗性基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢｏｍＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接,转化大肠杆菌Ｃ６００,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧链终止法测定了１０个克隆片段的ＤＮＡ顺序,结果表明,克隆的片段都含有启动子、核糖体结合优点及信号肽序列。克隆片段可以在大肠杆菌和枯草杆菌中恢复氨苄青霉素抗性的表型。β－内酰胺酶活力测定结果证明：大肠杆菌的酶活力主要积累在周质空间内而枯草杆菌的酶活力主要分泌到胞外。     

枯草杆菌启动子—信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗生基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢａｎＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接,转化大肠杆菌Ｃ６００,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ     

定点突变优化信号肽对嵌合抗原受体T细胞功能的影响

信号肽(signal peptide, SP)参与调节嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)结构的分泌水平及跨膜易位过程,对嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)行使功能至关重要,本研究通过定点突变技术优化SP序列,并研究其对CD19-CAR-T杀伤功能的影响。首先,利用基因合成和分子克隆技术,构建含野生型SP (SP-wtY)、2种突变型SP (SP-muK或SP-muR)的靶向CD19的CAR载体;对构建成功的载体进行慢病毒包装,并使用慢病毒侵染T细胞,利用流式细胞术检测细胞的转染效率,钙黄绿素释放法检测对靶细胞的体外杀瘤能力,酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)技术检测2种细胞因子[干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)和干扰素-α (interferon-α, TNF-α)]的分泌水平。结果显示,构建了野生型和信号肽突变的重组慢病毒质粒,慢病毒转导T细胞后,携带3种信号肽(SP-wtY、SP-muK或SP-muR)的CD19-CAR转染效率分别为33.9%、35.5%、36.8%。进一步杀伤实验显示,与SP-muK和SP-wtY细胞相比,SP-muR细胞的肿瘤杀伤效果显著提高,当效靶比为10:1时共培养24 h后,SP-muR组CAR-T细胞的细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌水平显著高于SP-muK和SP-wtY组。本研究揭示信号肽N端正电荷数的增加可以提高CAR的表达效率和对CD19⁺靶细胞的杀伤作用,为CAR结构的优化改造和临床高效应用提供了科学依据。     

猪miR-378种子序列的多态性对其功能以及胴体性状的影响

本研究旨在探索miR-378种子序列多态性对其结构、功能和猪胴体性状的影响.利用荣昌猪和亚洲野猪的单核苷酸多态性(SNP)进行群体遗传选择分析,预测miR-378种子序列的多态性对其结构的改变,统计不同猪种中等位基因频率;采用microRNA类似物验证种子序列多态性对miR-378在脂肪细胞中功能以及相关基因表达的影响...     

信号肽序列及其在蛋白质表达中的应用

信号肽在蛋白分泌的过程中起重要作用,分泌性蛋白质合成后由信号肽引导其穿过合成所在的细胞到其他组织细胞中。可以利用因特网在线工具和信号序列捕获系统来判定基因序列中是否含有信号肽序列。外源蛋白的表达形式多为细胞内不溶性表达(包涵体),少数为细胞外分泌表达。利用信号肽来引导外源蛋白分泌可避免因包涵体复性带来的困难。研究表明,多种外源基因连接上信号肽后在原核表达系统如大肠杆菌、L型细菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌中等都得到了分泌表达;信号肽也广泛应用于真核表达系统如毕赤酵母和昆虫杆状病毒表达系统,以提高蛋白的表达量。     

信号肽对酵母外源蛋白质分泌效率的影响

根据酵母表达系统在表达外源蛋白方面的独特优势,利用酵母表达系统高效分泌并纯化具有生物学活性的蛋白质,已受到广泛关注。信号肽在蛋白质的分泌中起着重要作用,可引导蛋白分泌至胞外,大大提高蛋白的表达量,在工业化生产外源蛋白的纯化工艺方面具有重要意义。该文将从酵母表达系统中对信号肽的选择、改造、偏爱密码子和增强子的应用等几个方面进行优化的探讨,以提高蛋白质在酵母系统中的分泌效率。     

海藻酸钠寡糖对小鼠免疫及抗氧化功能的影响

目的 研究海藻酸钠寡糖对小鼠免疫及抗氧化活性的影响。方法 采用不同浓度的海藻酸钠寡糖分别对小鼠连续灌胃15 d后,测量小鼠生长性能、小鼠胸腺和脾脏指数以及小鼠血浆中SOD和GSH的活性。结果 海藻酸钠寡糖能促进小鼠的生长性能,提高小鼠的胸腺和脾脏指数。其中给小鼠灌注高浓度的海藻酸钠寡糖15 d后,与对照组相比,小鼠的特定生长率和增重率分别提高了37.0%和48.5%（P<0.01）,小鼠胸腺和脾脏指数分别提高了18.8%和21.7%（P<0.01）。海藻酸钠寡糖还能增加小鼠的抗氧化活性,与对照组相比,灌注高浓度海藻酸钠组小鼠的SOD和GSH-Px活性分别提高了92.6%和35.9%（P<0.01）。结论 海藻酸钠寡糖能促进小鼠的生长性能,增强小鼠的免疫和抗氧化功能。     

高空气球飞行对凤尾鸡冠花抗氧化功能的影响

目的 :探讨高空气球飞行实验对鸡冠花抗氧化功能的影响。方法 :利用高空气球搭载了凤尾鸡冠花 (CelosiacristataL .cv.Plumosa)种子 ,进行空间诱变处理。飞行高度 4 0 .112km ,飞行时间近 4h ,回收后播种栽培 ,采收子一代 (SP1)花序 ,叶片。采用比色法研究搭载组和对照组花序、叶片水提取液对羟自由基 (·OH)和超氧阴离子自由基 (O·2 )的清除作用。同时 ,分别测定分析了各组样品VC、黄酮醇的含量和SOD活力 ,据此探索在高空环境影响后样品抗氧化活性变化与自由基清除剂含量之间的关系。结果 :各组水提取液均能降低·OH引发的还原型细胞色素C[Cyt·C(Ⅱ ) ]氧化作用和O·2 对羟胺的氧化作用 ,而两种搭载组样品水提取液清除活性氧的能力均比对照组显著提高。结论 :高空环境诱变处理对鸡冠花中抗氧化活性物质的合成和抗氧化功能产生了显著效应     

微生物发酵四君子汤制剂对荷瘤小鼠抗氧化功能的影响

目的探讨微生物发酵四君子汤制剂(FSJZD)对荷瘤小鼠抗氧化能力的影响。方法通过建立小鼠S180肿瘤模型,分别采用黄嘌呤法、硫代巴比妥酸法、硝酸还原酶法检测血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量,研究FSJZD的抗氧化能力。结果 FSJZD可显著升高荷瘤小鼠及CTX治疗荷瘤小鼠所致免疫抑制模型血清中的SOD水平,明显降低CTX所致免疫抑制小鼠血清中NO和MDA含量。结论 FSJZD能够显著提高荷瘤机体的抗氧化能力、降低化疗对机体产生的危害作用。     

牛膝多糖对草鱼免疫和抗氧化功能的影响

为探讨在饲料中添加牛膝多糖(ABP)对草鱼免疫和抗氧化功能的影响, 选取平均体重(88.130.76) g的健康草鱼375尾, 随机分成5个处理, 即基础饲料组、0.05 %、0.10 %、0.20 %、0.40 % ABP添加组, 每个处理3个重复, 每个重复25尾鱼, 饲养65 d。结果表明, 在饲料中添加ABP对草鱼头肾体指数影响不显著(P0.05), 对脾体指数影响显著(P0.05), 与对照组相比, 0.05 %、0.10 %、0.20 %和0.40%添加组脾体指数分别增加6.29% (P0.05)、28.00% (P0.05)、9.14%(P0.05)和13.14% (P0.05); 血液中NBT阳性细胞数随着ABP添加量的增加呈增加的趋势, 但各组间差异不显著(P0.05); 在饲料中添加ABP对草鱼血清白蛋白、白介素-１(IL-1)、白介素-6(IL-6)含量和过氧化氢酶活影响不显著(P0.05), 显著影响草鱼血清总蛋白(TP)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、-肿瘤坏死因子(TNF-)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量(P0.05)。与对照组相比, 0.40%添加组的TP和AKP分别增加24.64% (P0.05)和33.56% (P0.05); 0.20 %、0.40 %添加组的LZM活力分别增加34.97% (P0.05)和31.21% (P0.05), SOD活力分别增加27.28% (P0.05)和22.41% (P0.05); 饲料中随着ABP添加剂量的增加, 各组血清ACP活性先增加后缓慢下降, MDA含量先下降后上升。与对照组相比, 0.20%、0.40 %添加组ACP活性分别增加15.33% (P0.05)和11.10% (P0.05), 0.05%、0.10 %、0.20 %及0.40%添加组MDA含量分别下降11.97% (P0.05)、21.33% (P0.05)、32.37% (P0.05)和2.53% (P0.05)。饲料中随着ABP添加量的增加, 各组草鱼血清TNF-含量变化规律不明显, 但与对照组相比, 0.20%添加组TNF-含量显著增加(P0.05)。综上所述, 在草鱼基础日粮中添加适量牛膝多糖可以提高草鱼的免疫和抗氧化能力, 建议添加量为0.20%。       

水稻剑叶取向对其光合功能的影响

水稻的水平剑叶净光合速率 (Pn)和羧化效率(CE)显著高于直立剑叶 ,其胞间CO2 浓度 (Ci)显著低于直立剑叶 ,但两者的气孔导度 (Gs)没有明显差别。这表明剑叶取向对水稻叶片的光合能力有重要影响。水平剑叶的高Pn可能同其RuBP羧化酶含量和活性高有关。这可能是水平叶生长期间吸收光量较多的结果。     

从非同源蛋白质的一级序列预测其结构类

对基于氨基酸组成、自相关函数和自协方差函数提取特征的蛋白质结构类预测算法进行分析比较,对氨基酸组成和自相关函数相结合的方法,以及氨基酸组成和自协放差函数相结合的方法的预测算法进行了研究。结果表明：对非同源蛋白质,因氨基酸和自相关函数相结合的方法中,采用Miyazawa和Jernigan的疏水值时,训练的自检验的总精度为95．34％,其Jackknife检验的总精度为81．92％,检验加的他检验的总精工为86．61％。在氨基酸组成和自协方差函数相结合的方法中,采用Wold等的疏水值时,训练库的自检验的总精度为96．71％,其Jackknife检验的总精度为82．18％,检验加的他检验的总精工为86．88％。这说明氨基酸组成和自相关函数相结合的方法,以及氨基酸组成和自协方差函数相结合的方法可有效提高结构类预测精度,表明提取更多有效的序列信息是提高分类精度的关键。     

不同信号肽对毕赤酵母表达漆酶的影响

【目的】从毕赤酵母X-33的内源分泌蛋白中寻找高分泌能力的信号肽,以提高漆酶POXA1c的表达水平。【方法】通过二维电泳的数据分析,以及毕赤酵母的基因组测序结果筛选出7种毕赤酵母中高分泌水平的蛋白,利用其引导漆酶的分泌,通过测定漆酶的活力,来确定信号肽的分泌能力。【结果】七种信号肽都能引导漆酶的分泌,其中PHO5和FLO10信号肽,其引导下漆酶POXA1c的活力分别是自身信号肽引导下的2.5倍和2倍。组合信号肽FLO10-αpro和PHO5-αpro引导下漆酶的活力分别为自身信号肽引导下的3倍和3.5倍,分别比在α-MF引导下提高了20%和40%。【结论】毕赤酵母内源分泌蛋白的信号肽可以有效的引导外源蛋白的分泌,漆酶POXA1c在PHO5-αpro信号肽引导下,通过高密度发酵培养后,其漆酶活力达到57.98 U/m L。     

淡水鱼类功能多样性及其研究方法

目前,群落功能多样性备受生态学界关注,被认为是能解决生态问题的一种重要途径。我国对于群落功能多样性主要集中在植物群落和微生物群落,而在鱼类群落方面的研究几乎是空白。我国鱼类资源正面临着严重威胁,包括水坝建设导致的鱼类通道受阻、水库形成造成鱼类产卵场功能消失、过度捕捞、水质恶化和富营养化加重、外来种入侵等因素,导致渔业资源急剧衰退,水生生态系统功能下降。以淡水鱼类群落为例,对鱼类功能多样性的数据获取及处理分析与评价、测定指标及计算方法与研究难点等进行综述,以期为鱼类资源保护提供新的理论依据和切入点。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白N端信号肽对其DNA免疫应答的影响

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是近年来引起世界养猪业严重经济损失的重要病原之一,可引起繁殖母猪流产和新生仔猪呼吸道疾病.该病毒属于动脉炎病毒科,有美洲型和欧洲型两种血清型.基因组为单股正链RNA,大小15kb左右,含有9个开放阅读框（ORF）.由ORF5、6和7编码的GP5、M和N蛋白是病毒的主要结构蛋白.     

线粒体锚定对凋亡诱导因子抗氧化应激功能的影响

目的:构建带线粒体锚定信号肽的凋亡诱导因子(AIF)融合表达载体,研究在A549细胞中AIF线粒体锚定与其抗氧化应激功能的关系。方法:利用PCR将AIF原有线粒体定位信号(1-120 aa)替换成具有锚定功能的细胞色素c氧化酶Ⅳ亚型(COXⅣ)线粒体定位信号,并将COX-AIF克隆至pEGFP-N1和pDsRed1-N1载体,构建COX-AIF-GFP和COX-AIF-RFP融合表达载体;利用免疫印迹和激光共聚焦技术检测COX-AIF-GFP和COX-AIF-RFP的表达及其与线粒体的共定位;利用DCF染色和流式细胞技术检测A549细胞内过氧化物的水平。结果:表达了COX-AIF-GFP和COX-AIF-RFP融合蛋白,COX-AIF-GFP/RFP及AIF-RFP/RFP均定位于线粒体;与野生型AIF-RFP相比,COX-AIF-RFP可显著提高A549细胞的抗氧化应激能力。结论:AIF抗氧化应激能力依赖其在线粒体内膜的锚定。     

白藜芦醇对力竭训练动物能量代谢和抗氧化功能的影响

白藜芦醇具有多种生物学功能和药用价值,例如抗炎、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤等。为了探讨白藜芦醇在外源性抗氧化剂方面的开发价值。本研究建立了跑步力竭SD大鼠模型,应用不同浓度的白藜芦醇处理大鼠4周。研究显示,白藜芦醇处理可以剂量依赖性方式提高大鼠的跑步力竭时间(p<0.05)。白藜芦醇处理以剂量依赖方式降低大鼠血清乳酸和尿素氮水平并升高游离脂肪酸水平(p<0.05)。白藜芦醇处理以剂量依赖方式升高大鼠体内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶水平,并降低丙二醛水平(p<0.05)。白藜芦醇处理以剂量依赖方式降低血清肌酸激酶、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平(p<0.05)。此外,白藜芦醇明显减轻了大鼠骨骼肌的病理改变。因此,白藜芦醇可提高跑步力竭大鼠的抗疲劳能力,改善能量代谢方式,提高机体抗氧化能力,减少运动损伤。     

壬基酚对鲫鱼原代肝细胞增殖和抗氧化功能的影响

研究了不同浓度壬基酚对鲫鱼肝细胞增殖和抗氧化系统的影响.结果表明：各试验浓度壬基酚均能抑制鲫鱼肝细胞的增殖,其中高浓度的壬基酚（10^-3 mol·L^-1）对细胞增殖的抑制作用极其显著,肝细胞形态发生明显改变;壬基酚破坏了鲫鱼肝细胞抗氧化系统的平衡,经壬基酚处理后的肝细胞超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性均受到抑制,而羟自由基的含量升高;壬基酚对原代鲫鱼肝细胞造成氧化损伤,引起培养液中丙二醛（MDA）含量升高.壬基酚诱导的氧化胁迫对原代鲫鱼肝细胞产生了一系列的体外毒性效应.