RNA干扰基因表达对哮喘小鼠支气管上皮细胞凋亡的影响

为了研究RNA干扰基因表达对哮喘小鼠支气管上皮细胞凋亡的影响,本研究拟通过RNA干扰技术降低Toll样受体表达,检测其是否对缓解哮喘小鼠的支气管上皮细胞凋亡发挥作用。本实验将30只小鼠,雌雄各半,随机分为对照组、哮喘组以及干预组3组。哮喘造模成功后,原代培养各组小鼠的支气管上皮细胞,4~8代后进行si RNA干扰。通过RT-PCR以及TUNEL的方法分别检测小鼠细胞内Toll样受体的基因表达量和细胞凋亡情况。结果显示,哮喘的小鼠Toll样受体的表达明显升高,支气管上皮细胞凋亡比例也比较高,与对照组小鼠进行比较,两种指标均有统计学差异;而si RNA进行干扰后,相较于哮喘组,Toll样受体的表达量明显下降;且凋亡细胞的比例也明显下降,与哮喘组进行比较,两组间有明显的统计学差异。本研究在小鼠模型中验证了用RNA干扰技术对Toll样受体基因表达的干预作用,并且也证明此技术能明显改善哮喘小鼠的病理表型,是非常有前景的临床治疗方法,为临床推广提供了较为可靠的基础实验证据。     

敲减DTX4表达抑制C2C12细胞成肌分化

DTX4（Deltex 4 homolog）蛋白属于Deltex家族成员|Deltex家族是Notch信号通路的调节因子. 已知Notch信号通路在成肌分化中发挥重要作用. 然而,DTX4是否参与调控肌肉发育尚未有报道. 本研究探索DTX4对成肌分化的影响及作用机制. 实时定量PCR和蛋白质印迹分析揭示,伴随小鼠C2C12成肌细胞（myoblast）分化为肌管（myotube）过程,成肌分化标志蛋白肌球蛋白重链（myosin heavy-chain,MyHC）、肌细胞生成素(myogenin)表达逐渐升高,DTX4 mRNA及蛋白质表达水平也逐渐升高. 通过顺序专一的siRNA敲减DTX4表达后,C2C12成肌细胞肌管面积和肌管融合指数明显减少|MyHC、肌细胞生成素蛋白表达水平明显降低|但ERK信号通路未见明显变化.上述结果表明,敲减DTX4表达抑制C2C12细胞成肌分化.我们的结果提示,DTX4可能参与C2C12细胞成肌分化.     

小鼠肌肉生长抑制素基因短发夹RNA促进MyoD在C2C12细胞中的表达

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族,主要功能为负向调节骨骼肌的生长.肌肉生长抑制素基因敲除小鼠肌肉出现显著增加,而将干涉该基因的短发夹RNA注射并电击转化入大鼠胫前肌则引起肌肉重量、肌纤维以及MHCⅡ表达的增加.通过与小鼠肌肉生长抑制素基因表达载体共转染HEK293细胞,筛选到两条能够高效抑制小鼠肌肉生长抑制素基因表达的小干涉RNA.构建了这两条小RNA的表达载体Mst-shRNA1和Mst-shRNA2,用其分别转染小鼠C2C12成肌细胞,并通过G418药物筛选和流式细胞仪富集整合了短发夹RNA表达载体的阳性细胞.通过采用Real-time PCR和Western blot分析,检测到在分别整合了Mst-shRNA1和Mst-shRNA2的C2C12细胞中,内源性肌肉生长抑制素基因的mRNA水平分别下降了10.2%和35.5%,蛋白质表达则分别下降了29.3%和64.7%.同时,在这两组中MyoD的表达上升了24.4%和40.4%,证明通过RNA干涉实现的肌肉生长抑制素基因的抑制导致了下游MyoD基...     

干扰Sema7A抑制C2C12成肌细胞的增殖和分化

为研究脑信号蛋白家族（Semaphorins）成员Sema7A对成肌细胞增殖和分化的影响,本文设计并合成了Sema7A基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,用此siRNA转染C2C12成肌细胞．通过Hoechst核染和流式细胞术检测细胞增殖情况,免疫荧光检测肌管的形成情况,real-time qPCR和Western印迹技术检测成肌标记基因的变化.结果显示,干扰Sema7A后,C2C12成肌细胞增殖减慢,处在G2和S期的细胞所占的比例明显下降,而G1期细胞的比例升高．免疫荧光检测结果显示,干扰Sema7A后,肌管的直径及MyHC+细胞所占比例均显著降低．Real-time qPCR和Western印迹结果也显示,肌肉分化标志基因MyoD、MyoG、MyHC的mRNA及蛋白质表达均下降．进一步检测Sema7A受体下游信号通路发现,干扰Sema7A后,其下游信号分子PI3K和AKT的磷酸化水平被下调．以上结果表明,Sema7A可以调节C2C12成肌细胞的增殖和分化,可能是通过其受体作用于PI3K/AKT信号通路实现的,这为进一步研究Sema7A在骨骼肌发育中的作用提供实验基础.     

重组肌肉抑制素功能分析及其对鸡肌肉发育的抑制作用

肌肉抑制素 (myostatin)为TGF β超家族成员 ,具有典型的TGF β家族成员特有的分子结构与功能。为了深入阐明肌肉抑制素的作用机制 ,研究了重组肌肉抑制素蛋白对鸡胚成肌细胞和小鼠C2 C1 2 成肌细胞增殖与分化的作用 ,同时制备了肌肉抑制素特异性抗体。实验结果表明 ,重组肌肉抑制素对于成肌细胞的增殖过程具有极强的抑制作用 ,主要表现为抑制细胞周期由G1 期向S期的过渡 ,细胞生长速度显著变慢 ;同时重组肌肉抑制素也抑制成肌细胞分化为多核的融合肌管细胞 ,抑制肌肉分化标志myogenin和MHC的表达。由重组蛋白质制备的抗体能够特异性地识别人、小鼠、大鼠和鸡肌肉组织的内源肌肉抑制素。此外 ,通过免疫荧光技术还证实 ,肌肉抑制素主要定位于胞液中     

白假丝酵母相关Toll样受体的研究进展

白假丝酵母引起的疾病越来越多,其表现也多种多样,尤其是细胞免疫缺陷病人会产生威胁生命的系统性真菌病,其病死率为35%,天然免疫在抵御该菌感染方面具有特别重要的意义,宿主细胞通过模式识别受体识别各种微生物的病原体相关分子模式,而Toll样受体和Nod蛋白是两类参与天然免疫的模式识别受体,其中Toll样受体家族在抗真菌感染中起非常重要的作用.本文对人体中该受体的概况,以及与抗白假丝酵母紧密相关的Toll样受体2和Toll样受体4作一综述.     

Toll样受体信号转导途径研究进展

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)属于模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)家族,识别高度保守的微生物组分-病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pat-terns,PAMPS)。迄今为止,在人类基因组中已发现10个Toll样受体。这些受体通过感知不同的微生物刺激,招募特异接头蛋白,激活一系列信号级联反应,引发针对病原体的特异性免疫应答,是连接天然免疫和适应性免疫应答的桥梁。哺乳动物Toll样受体的发现引领天然免疫的研究进入飞速发展的时代。本文将对Toll样受体信号转导途径的最新进展作一综述,以便更好地理解Toll样受体介导的分子免疫机制,这将有助于研发免疫治疗的分子靶标,最终有效预防、控制Toll样受体介导的疾病。     

Toll样受体靶向药物的研究进展

Toll样受体是一类进化上高度保守的模式识别受体,通过多种信号传递途径调节免疫系统功能,活化后可诱导多个蛋白质家族的表达,包括炎性细胞因子、I型干扰素和趋化因子。Toll样受体的过度活化或活化不足均会导致机体功能异常,其与免疫系统疾病、肿瘤发病机制密切相关,是个非常值得开发的新型治疗靶点。现就对目前已开发Toll样受体药物进行了研究,对其治疗效果及临床进展做一简要综述,以期为临床预防和治疗疾病提供参考。     

TLR4及其作用的研究进展

Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)因其积极的研究成果而成为近年来广受关注的一种病原体识别受体,TLRs分布相对比较广泛,不但在小肠上皮、呼吸上皮细胞表达,同时也在血管内皮细胞、树突状细胞[1]、大鼠脾及心肌细胞[2]等细胞中表达.研究证实,它属于模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),病原相关分子模式(pathogen-associated molecule pattern,PAMPs)可被其辨别,然后引发一系列的信号转导,TLRs 是备受关注的一种PRRs.Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)是TLRs家族中极为重要的成员,是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体,在天然免疫反应中扮演着关键性作用.细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为一类受体,主要作用是介导信号跨膜转导,尤其对革兰氏阴性菌所引起的感染性炎症起着极为关键的作用.由于近年来对TLR4介导的信号转导及TLR4与疾病的关系研究成为热点,本文就TLR4的信号转导、TLR4与LPS的关系及TLR4信号通路调节进行综述如下.     

Egr1对小鼠成肌细胞C2C12分化的影响

早期生长反应蛋白1(early growth response protein 1,Egr1)作为转录因子在细胞增殖、分化及凋亡等许多生物学过程中都扮演着重要角色,但是其对小鼠成肌细胞C2C12分化的影响尚不明确。该研究采用Western blot和免疫荧光技术检测Egr1在C2C12细胞分化过程中的表达规律及定位。利用CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9技术分别激活和抑制Egr1的表达,进而探讨Egr1对C2C12细胞分化的影响。结果显示,随着C2C12细胞分化的进行,Egr1的表达量在分化的第5 d达到峰值,随后呈下降趋势。Egr1表达定位于C2C12的细胞核与细胞质中,随着分化的进行,其在细胞核和细胞质中的表达量均显著升高。分别激活或抑制Egr1后,C2C12细胞肌管融合率以及肌肉分化标志分子肌细胞生成蛋白(myogenin,MYOG)和肌球蛋白重链2(myosin heavy chain 2,MYH2)水平均显著增加或降低。该研究结果表明,Egr1能够促进体外小鼠成肌细胞C2C12的分化。     

KLFs转录因子在山羊成肌细胞分化过程中的表达模式

本研究旨在研究KLFs家族6个成员(KLF3,KLF5,KLF7,KLF8,KLF9和KLF12)在山羊成肌细胞诱导分化过程中的表达模式及各个成员的相关性。利用qPCR检测KLFs在成肌细胞不同分化阶段中的表达丰度,并分析该家族成员间的相关性。结果显示,KLF3、KLF5、KLF7、KLF8、KLF9和KLF12在成肌细胞诱导分化过程中的表达水平逐渐升高,在诱导分化96 h的表达水平均极显著高于未诱导细胞中的表达水平(p0.01);相关性分析结果显示6个成员mRNA表达水平存在极显著相关(p0.01)。本研究明确了KLF3、KLF5、KLF7、KLF8、KLF9和KLF12在山羊成肌细胞诱导分化过程中的表达模式,为阐明该家族在山羊肌肉生长发育中的调控作用提供重要的基础数据。     

C2C12成肌细胞诱导肌性分化过程中miR-101a的表达

以C2C12成肌细胞为模型,在分化培养基中诱导C2C12建立体外肌性细胞分化模型.以poly (A)3′-端加尾和实时定量PCR方法研究miR-101a在C2C12细胞分化过程中的表达情况.结果发现,在细胞转入分化培养基进行肌性分化的1-5 d中,miR-101a的表达量逐渐增加,提示miR-101a可能在肌肉发生中发挥调控作用.     

Duchenne型肌营养不良症发病机制

Duchenne型肌营养不良症是我国常见的X连锁隐性遗传性肌病。目前广泛应用的动物模型是mdx小鼠,但其没有很好地模拟人类疾病特点。最近,Sacco等报导了一个新的小鼠模型mdx/mTRG2,它不仅有抗肌萎缩蛋白的缺陷,还有端粒酶的缺失,较好地模拟了人类疾病的症状。通过该模型,人们认识到抗肌萎缩蛋白的缺陷引起肌细胞退化,肌肉干细胞被激活对抗其退化,但干细胞的过度增殖又导致端粒长度下降,引起肌肉干细胞增殖能力的衰竭,最终产生了肌营养不良的表型。该模型使人们对Duchenne型肌营养不良症的发病机制有了进一步的理解,为其治疗提供了新的研究平台。     

TOLL样受体9在动脉粥样硬化中的作用研究进展

动脉粥样硬化是一种慢性免疫炎症性疾病,它与自身的先天性免疫和适应性免疫密切相关。Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)作为激活非特异性免疫的重要受体蛋白,可以识别病原微生物,激活免疫反应。Toll样受体9是TLR家族中的重要一员,是先天免疫系统中识别细菌和病毒Cp G DNA的重要受体,其与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生发展紧密相关。研究发现,TLR9与动脉粥样硬化的发生、发展(内皮受损和泡沫化细胞形成)密切相关,但也有研究发现TLR9在AS进程中具有潜在的保护效应。本文对Toll样受体9与动脉粥硬化疾病之间关系做一个简要的阐述,简明的总结了TLR9与树突细胞及自噬之间的联系,并为其作为靶点治疗动脉粥样硬化提供新的思路。     

NF-κB信号通路与骨骼肌萎缩

骨骼肌萎缩发生于多种生理和疾病状态下,如废用、衰老和慢性病。核因子-κB(NFκB)信号通路包括NF-κB、抑制蛋白-κB(IκB)和IκB激酶(IKK),它们在肌萎缩中起着重要作用,能够引起肌肉蛋白质降解、诱导炎症、阻断损伤/萎缩后肌纤维的再生。NF-κB转录靶包括MuRF-1、YY1和MMP-9,还可通过转录后机制调节MyoD。而且,应用遗传操作小鼠模型已证明NF-κB还是防止骨骼肌萎缩的重要分子靶标。该文将综述NF-κB在骨骼肌萎缩中的作用,为开发新的方法治疗肌萎缩提供参考。     

NLRP3炎性小体在肌肉骨骼系统疾病中的作用

炎性小体是先天性免疫系统的受体和传感器,在许多疾病的发生和进展中起着关键的病理作用。近期研究表明,NOD样受体家族核苷酸结合寡聚化结构域样受体3 (NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)炎性小体参与了对公共健康具有高度影响的疾病的发生,如肌肉骨骼系统疾病。肌肉骨骼系统疾病是主要由工作和周围环境引起或加重的肌肉、关节、骨骼等运动系统疾病,以及相关神经、循环系统损伤的疾病。NLRP3小体的激活可以诱导炎症及引发焦亡,造成机体进一步损伤。因此,以NLRP3炎性小体为切入点,开展对肌肉骨骼系统疾病的预防和治疗具有重要意义。研究炎症性疾病中NLRP3炎性小体活动的机制及作用已然成为新的研究方向。本文对NLRP3炎性小体的激活途径及机制进行了概述,并分析了NLRP3炎性小体在肌少症、骨质疏松症和关节炎等肌肉骨骼系统疾病中的作用,以期为肌肉骨骼系统疾病的治疗提供理论依据。     

消化性溃疡患者外周血单个核细胞Toll样受体4的表达及TNF-α水平的研究

目的:研究消化性溃疡患者Toll样受体4的表达及血清TNF-α浓度水平,探讨其与幽门螺杆菌感染的关系.方法:选取24例幽门螺杆菌(helicobacter.pylori,HP)阳性和16例HP阴性消化性溃疡患者,分别运用半定量PCR(Semi-quantitative RT-PCR)法、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法测定其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs) Toll样受体4的表达及血清TNF-α浓度.结果:HP阳性和HP阴性消化性溃疡患者PBMCs中均有TLR-4 mRNA的表达,HP阳性患者PBMCs TLR-4 mRNA的表达显著高于HP阴性组患者(P＜0.01),HP阳性组患者血清TNF-α水平亦显著高于HP阴性组患者(P＜0.01),TLR-4 mRNA表达水平与血清TNF-α水平呈正相关(r=0.21,p=0.02).结论:HP阳性消化性溃疡患者外周血单个核细胞TLR-4 mRNA表达水平上调,血清TNF-α水平也同步升高,TLR4与HP感染所致消化性溃疡病理过程密切相关.     

运动调控昼夜节律在抗肌萎缩中的作用

随着全球老龄化进程加剧,老年人口剧增,伴随着工作和生活方式的改变,导致体育锻炼减少与生活作息不规律等问题愈发严重。这样的结果显著增加了骨骼肌萎缩的发病率,降低了老年和慢性疾病人群机体健康,影响其生活质量。与此同时,饮食不均衡和运动量降低以及激素水平波动等进一步加剧骨骼肌萎缩的发生,其病理机制主要为慢性炎症加重、线粒体功能障碍、自噬功能状态低下、细胞凋亡增加、肌卫星细胞功能受损以及昼夜节律紊乱等。其中,随着昼夜节律相关研究的深入,骨骼肌作为机体最大的外周生物钟,可通过调控昼夜节律核心基因BMAL1以及CLOCK基因,对骨骼肌纤维结构、线粒体功能、肌肉质量等产生影响。运动锻炼作为改善骨骼肌质量的重要干预策略,还可激活昼夜节律信号通路,调控其相位,进而改善肌肉再生、提高肌肉力量,发挥延缓肌萎缩作用。为此,本文从昼夜节律的角度去阐述其与肌萎缩发生以及潜在运动干预的分子机制,以期为肌萎缩的预防、治疗及康复提供新的靶向思路。     

人凝血因子ⅨcDNA在C2C12成肌细胞及C3H小鼠中的高效表达

以小鼠C2C12成肌细胞为对象开展血友病B基因治疗研究.除已有的XLIX,LNCIX和GlNaCIX反转录病毒载体外,又首次将微小MCK(muscle creatinekinase)增强子顺序构建到hCMV(human cytomegalovirus)启动子上游,共同控制FIXcDAN的转录.用带有上述4种载体的病毒悬液分别感染C2C12细胞后,ELISA检测结果发现,FIX蛋白离体表达水平为:G1NaMCIX>GlNaCIX>LNCIX>XLIX.其中C2C12/G1NaMCIX混合克隆高达640ng/(10~6细胞·24h).C2C12/G1NaMCIX细胞注射C3H小鼠后肢骨骼肌肉组织,人FIX蛋白持续表达35d,其中最高表达峰达206ng/mL血浆.此结果对于研究FIX cDNA在脱细胞中的表达调控以及采用成肌细胞移植途径开展血友病B基因治疗研究有重要意义.     

Toll样受体增强树突状细胞中腺苷受体A2B亚型的表达及功能

树突状细胞(dendritic cell,DC)表面所表达的腺苷受体A2B亚型(ADOR-A2B)可促进DC对辅助性T淋巴细胞(T helper cell,Th)的激活,导致自身免疫性疾病的发生或加重.本文旨在研究作为免疫反应的诱导分子Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是否可调节ADOR-A2B在DC中的表达并籍此影响其功能.体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞(BM-DC),以多种TLRs的配体,Pam3csk4、polyIC、LPS及CpG进行干预.提取细胞总RNA,real-time PCR测定ador-a2a、ador-a2b的表达;放射性配体结合实验测定BM-DC对3H-腺苷结合能力的变化.以LPS及选择性ADOR-A2B激动剂BAY 60-6583协同干预BM-DC,ELISA测定培养基中IL-1、IL-6及IL-12的含量.以干预后的BM-DC刺激naive CD4细胞,ELISA测定培养基中IL-17A、IFNγ的含量,荧光抗体染色及流式细胞仪分析检测CD4细胞的分化.结果显示,TLR-4的配体LPS可显著提高BM-DC中ador-a2b的表达及对腺苷的结合能力.BAY 60-6583与LPS相协同可刺激BM-DC分泌多种致炎因子,并增加其诱导CD4细胞向Th1及Th17分化的能力.由此可见,Toll样受体可上调adora2b在DC中的表达,并可籍此增加DC分泌促炎因子的能力及对CD4细胞的刺激作用.